Desacoplamiento de las tasas de respiración y la abundancia en el procarioplancton marino

Nature, volumen 612, páginas 764–770 (2022)Citar este artículo

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El intercambio océano-atmósfera de CO2 depende en gran medida del equilibrio entre la fotosíntesis microbiana marina y la respiración. A pesar de la gran diversidad taxonómica y metabólica entre las bacterias planctónicas marinas y las arqueas (procarioplancton)1,2,3, su respiración generalmente se mide a granel y se trata como una "caja negra" en los modelos biogeoquímicos globales4; esto limita la comprensión mecanicista del ciclo global del carbono. Aquí, utilizando una tecnología para análisis de fenotipo integrado y secuenciación genómica de células microbianas individuales, mostramos que las tasas de respiración específicas de las células difieren en más de 1000 veces entre los géneros de procarioplancton. Se descubrió que la mayoría de la respiración la realizaban miembros minoritarios del procarioplancton (incluido el grupo Roseobacter), mientras que las células de los linajes más frecuentes (incluidos Pelagibacter y SAR86) tenían tasas de respiración extremadamente bajas. El desacoplamiento de las tasas de respiración de la abundancia entre linajes, los recuentos elevados de transcritos de proteorrodopsina en células Pelagibacter y SAR86 y la respiración elevada de SAR86 durante la noche indican que la fototrofia basada en proteorrodopsina3,5,6,7 probablemente constituye una fuente importante de energía para el procarioplancton y puede aumentar la eficiencia del crecimiento. Estos hallazgos sugieren que la dependencia del procarioplancton de la respiración y la remineralización del carbono orgánico derivado del fitoplancton en CO2 para sus demandas de energía y crecimiento puede ser menor de lo que comúnmente se supone y variable entre linajes.

El enfoque de caja negra para la respiración del procarioplancton presenta un marcado contraste con la abrumadora evidencia de la considerable diversidad filogenética y genómica del procarioplancton1,2,3 y las grandes diferencias en las tasas de crecimiento y absorción de sustrato orgánico entre los linajes, como lo indica la microautorradiografía de hibridación in situ con fluorescencia (MAR -FISH)8, espectrometría de masas de iones secundarios a nanoescala FISH (nanoSIMS)9 y sondeo de isótopos estables (SIP)10. Algunos de los procesos metabólicos predichos por el genoma, como la fototrofia basada en proteorrodopsina3,5,6, pueden tener un efecto directo sobre la respiración del procarioplancton y la liberación de CO2 a la atmósfera, pero su importancia global sigue siendo poco restringida. Aquí desarrollamos un método para medir la tasa de respiración de oxígeno in situ integrado y la secuenciación genómica de células microbianas individuales para mostrar que las tasas de respiración difieren en más de tres órdenes de magnitud entre los géneros de procarioplancton. Nuestros resultados proporcionan evidencia de la importancia de la fototrofia de la proteorrodopsina como fuente de energía complementaria para la respiración en los linajes de procarioplancton prevalentes y su impacto potencial en el ciclo global del carbono. Estos hallazgos demuestran la viabilidad de vincular directamente los genomas y fenómenos microbianos en la resolución de una sola célula y enfatizan la importancia de dividir la caja negra del procarioplancton marino en componentes funcionalmente más significativos en los modelos de ecosistemas.

RedoxSensor Green (RSG) se ha utilizado anteriormente en estudios ambientales y de laboratorio de diversos microorganismos como sonda de viabilidad celular específica para la actividad de la oxidorreductasa11. Para evaluar la viabilidad de usar RSG de manera cuantitativa, analizamos la relación entre el consumo de oxígeno a granel y la fluorescencia de RSG de una sola célula en cultivos puros de bacterias acuáticas filogenéticamente diversas (el flujo de trabajo metodológico se ilustra en Datos extendidos Fig. 1 y Tabla complementaria 1). Las células de fase estacionaria variaron en la intensidad de la fluorescencia RSG en todos los cultivos (datos extendidos, figura 2a), lo que indica una heterogeneidad fisiológica consistente con estudios previos12,13, pero eran distintas de los controles negativos (datos extendidos, figura 2b). La fluorescencia promedio por célula se correlacionó con la tasa promedio de consumo de oxígeno por célula dentro del rango analizado (alrededor de 1 a 1000 amol de O2 por célula por hora, R2 = 0,86), sin evidencia de sesgos taxonómicos (Fig. 1a). Esta calibración de cultivo permitió el uso de la intensidad de fluorescencia RSG como indicador de la tasa de respiración de una célula individual.

a, Comparación de la intensidad de fluorescencia RSG normalizada con las tasas de consumo de O2 específicas de células en cultivos de laboratorio. Cada punto representa un experimento de cultivo (n = 50), con los valores de fluorescencia normalizados a los estándares de perlas de fluorescencia utilizados para intercalibrar el instrumento. Se proporcionan detalles experimentales adicionales en la Tabla complementaria 1. b, Comparación de las tasas de respiración de procarioplancton marino a granel determinadas utilizando Winkler y los métodos RSG específicos de células (n = 12). Para el método RSG, la tasa de respiración promedio por célula se calculó a partir de las tasas de respiración por célula y luego se usó para calcular la cantidad total de O2 consumido junto con el número de células marcadas con RSG por ml. En ambos gráficos, el área sombreada más oscura representa el intervalo de confianza del 95 % y el área sombreada más clara es el intervalo predicho del 95 %, alrededor de la línea de regresión.

Para validar el uso de RSG en la cuantificación de la respiración en estudios ambientales, realizamos mediciones simultáneas de sondeo de RSG de una sola célula y respiración a granel utilizando la metodología tradicional de Winkler14 en muestras de procarioplancton geográficamente diversas en condiciones in situ. Las tasas de consumo de O2 específicas de las células se calcularon utilizando la calibración de cultivo (Fig. 1a) y se usaron para estimar las tasas de consumo a granel. Ambas técnicas produjeron estimaciones similares del consumo de O2 en todo el rango analizado de 0,008–2,3 µmol O2 por l por hora (Fig. 1b). Esto proporcionó más evidencia de que RSG puede usarse como un indicador de las tasas de respiración de oxígeno microbiano en un contexto ambiental. Sobre la base de una variedad de muestras de control muertas, se encontró que el umbral de detección analítico específico de la célula era de alrededor de 4 amol O2 por célula por hora (Datos extendidos Fig. 3a,b) en muestras ambientales. La abundancia de células más baja que pudimos cuantificar utilizando nuestro análisis de citometría de flujo fue de alrededor de 106 células por l (ref. 15). Esto se traduce en un límite de detección teórico de las mediciones de respiración de la comunidad microbiana basadas en RSG de alrededor de 4 pmol de O2 por l por hora, que es aproximadamente cuatro órdenes de magnitud más bajo que los ensayos estándar de consumo de O2 que utilizan Winkler o detección de sensores optode14. Por lo tanto, el enfoque RSG puede permitir mediciones de respiración microbiana en entornos de baja biomasa y/o baja actividad, en los que los métodos actuales carecen de sensibilidad. Además, el sondeo RSG tarda solo unos minutos, lo que aumenta la resolución temporal de la medición y reduce el riesgo de efectos de botella en comparación con las incubaciones típicas de ≥24 h de duración para las mediciones de Winkler4. Es importante destacar que este enfoque mide de manera única la respiración en la resolución de células individuales y de manera no destructiva, lo que ofrece oportunidades para estudiar la variabilidad en la respiración intercelular y combinarla con otros análisis de las mismas células.

Para comparar las tasas de respiración entre los linajes de procarioplancton y relacionar esas mediciones con el contenido del genoma y el tamaño celular de los linajes, realizamos un sondeo RSG y la genómica unicelular posterior en seis muestras marinas de procarioplancton recolectadas en la costa del Golfo de Maine (GoM; 43,86° N , 69,58° W) durante un período de dos años (Tabla complementaria 2). Se generaron y secuenciaron genomas amplificados únicos (SAG) utilizando técnicas descritas anteriormente16, con el uso adicional de RSG como fuente de fluorescencia en la clasificación de células por citometría de flujo, durante el cual se registraron las propiedades ópticas de cada célula. Posteriormente, se utilizó la intensidad de dispersión de la luz en el ángulo frontal para estimar el diámetro de cada celda16. La fluorescencia RSG específica de células en tres de estas muestras, recolectadas en octubre de 2018, abril de 2019 y julio de 2019, se convirtió en tasas de respiración utilizando la calibración de cultivo descrita anteriormente. Debido a cambios en la configuración del instrumento, las tres muestras anteriores, recolectadas en 2017, se analizaron de manera similar pero sin la conversión cuantitativa de la fluorescencia RSG en tasas de respiración.

Recuperamos una fracción similar de genomas de células individuales que se probaron con RSG o con la tinción de ácido nucleico SYTO-9 de uso común, lo que demuestra la compatibilidad de RSG con la amplificación y secuenciación de ADN de una sola célula aguas abajo (Datos extendidos Fig. 3c). Las estimaciones basadas en RSG de las tasas de respiración a granel tenían un rango de 0,35 a 0,78 µmol O2 por l por hora, en consonancia con las mediciones anteriores en el GdM17 y otros entornos costeros18. Las tasas de respiración estimadas de las células individuales abarcaron más de cinco órdenes de magnitud, desde debajo de la detección (<0,004 fmol O2 por célula por hora) hasta alrededor de 145 fmol O2 por célula por hora (Fig. 2a, Datos extendidos, Fig. 4 y Tabla complementaria 3). ). Aunque se produjo una variación sustancial en las tasas de respiración incluso entre células con genomas casi idénticos, las células con una identidad de aminoácidos promedio predicha superior al 60% tenían tasas de respiración más uniformes en comparación con las células con una mayor divergencia del genoma, lo que corresponde aproximadamente al límite entre géneros en contemporáneo. taxonomía de procariotas (Fig. 2b). Por lo tanto, para simplificar nuestro conjunto de datos de una manera biológicamente significativa, agrupamos los SAG a nivel de género.

a, La composición filogenética, las tasas de respiración y los diámetros de las células de procarioplancton individuales recolectadas en octubre de 2018. Se muestra el árbol de máxima verosimilitud del gen 16S rRNA que estaba enraizado en Archaea. Los valores de arranque superiores a 0,75 se indican mediante círculos negros. Los géneros están separados por sombreado gris y blanco. Se muestran los nombres de los géneros discutidos en este Artículo. Las entradas de referencia de aislados cultivados se indican con un asterisco rojo. b, La relación entre la identidad de aminoácidos y la proporción de consumo de O2 en pares de células recuperadas de la misma muestra. La línea negra indica la relación de consumo medio de O2 en intervalos del 1 % y el área sombreada en gris está delimitada por el cuantil del 10 % por debajo y el cuantil del 90 % por encima. c, Abundancia de células específicas de género sobre la base del reclutamiento de lectura metagenómica. d, tasas de respiración por célula específicas de género. Los diagramas de caja y bigotes indican la mediana (línea central), el primer y tercer cuartiles (límites de caja) y el rango intercuartílico de 1,5 × (bigotes). Los puntos indican valores atípicos fuera del rango intercuartílico de 1,5 ×. e, La fracción de respiración de procarioplancton realizada por cada género. Incluidos en c–e están los diez géneros más abundantes y los diez géneros con la mayor contribución a la respiración de la comunidad. Las líneas grises verticales separan los géneros. Los colores en c–e son como se definen en a. Tenga en cuenta que las estimaciones de respiración específicas del género tienen en cuenta las celdas que se encuentran por debajo del límite de detección RSG, como se describe en los Métodos. Para c–e, la fecha de muestreo se indica en la parte superior izquierda de c y el número de células ordenadas y secuenciadas por día fue n = 282 (30 de octubre de 2018), n = 274 (2 de abril de 2019) y n = 277 (9 julio de 2019).

Nuestros resultados revelaron diferencias sustanciales en las tasas de respiración específicas de las células y las contribuciones al consumo de oxígeno del procarioplancton entre los géneros (Fig. 2c-e). En el extremo superior del espectro, los géneros ASP10-02a (Gammaproteobacteria), LFER01 y Planktomarina (ambos miembros del clado Roseobacter, Rhodobacteraceae, Alphaproteobacteria) contenían células que respiraban más de 1 fmol de O2 por célula por hora. Planktomarina aportó del 10 al 37 % del consumo total de O2 en los tres puntos de tiempo, mientras que comprende solo del 1,2 al 2,5 % de las células. Las células con tasas de respiración intermedias de 0,01–1 fmol O2 por célula por hora estaban dominadas por Amylibacter (clado Roseobacter), varios géneros de Bacteroidia, el género Gammaproteobacteria Thioglobus y varios géneros menos abundantes (Datos ampliados, Fig. 5). En el extremo inferior del espectro, 99 de los 303 géneros identificados no contenían células que excedieran nuestro límite de detección de alrededor de 0,004 fmol O2 por célula por hora. En particular, tres de los cinco géneros más prevalentes no contenían células que respiraran más de 0,03 fmol O2 por célula por hora en ningún momento: el género Pelagibacter de Alphaproteobacteria y dos géneros del grupo SAR86 de Gammaproteobacteria (AAA076-P13 y D2472). Pelagibacter y SAR86 constituyeron colectivamente del 22 al 24 % de todas las células en los puntos de tiempo, mientras que representaron solo del 0,6 al 5,6 % de la respiración total del procarioplancton. La estimación basada en RSG del consumo promedio de O2 de Pelagibacterin GoM (alrededor de 5,0 amol de O2 por célula por hora) fue similar a las mediciones anteriores en un cultivo en fase estacionaria (alrededor de 1 a 10 amol de O2 por célula por hora)19. De manera similar, se ha informado que el clado Roseobacter y ASP10-02a están sobrerrepresentados entre las células de procarioplancton más activas en las floraciones de algas y los ambientes costeros20,21,22. Por lo tanto, nuestros hallazgos están en general de acuerdo con estudios previos, lo que sugiere que los análisis de una sola célula basados ​​en RSG ofrecen una evaluación realista de las diferencias en las tasas de respiración entre los taxones de procarioplancton.

Al considerar los tres experimentos en los que se cuantificó la respiración celular específica, las diferencias estacionales más pronunciadas se observaron en el género gammaproteobacterial ASP10-02a y varios géneros de Flavobacteriaceae (Bacteroidia) (Fig. 2c, d). Estos géneros tuvieron las tasas de respiración específicas de células más altas y la abundancia de células en abril de 2019. De manera similar, Flavobacteriaceae y ASP10-02a tuvieron una fluorescencia RSG elevada y una abundancia de células relativa en abril en comparación con agosto y noviembre, en los experimentos no calibrados de 2017 ( Datos extendidos Fig. 6). Aunque este estudio tiene una resolución temporal limitada, cabe destacar que los dos experimentos de abril se llevaron a cabo durante o poco después de las floraciones de algas de primavera en el GoM (Datos ampliados, Fig. 3d). Nuestros hallazgos son consistentes con informes previos de Flavobacteriaceae23,24,25,26 y ASP10-02a21 asociados con floraciones de algas. En particular, la mayoría de los otros géneros de procarioplancton no tuvieron diferencias pronunciadas en las tasas de respiración específicas de las células entre las fechas de muestreo, a pesar de las grandes diferencias estacionales en la temperatura y la productividad primaria en el GdM27.

Realizamos análisis genómicos y de respiración unicelular similares de muestras de ubicaciones geográficamente diversas en alta mar en los océanos Atlántico y Pacífico (Tabla complementaria 2). En promedio, los microorganismos de estos entornos oligotróficos tenían tasas de respiración por célula más bajas en comparación con el procarioplancton del GoM. Al igual que GoM, muchos de los linajes más abundantes, incluidos Pelagibacter y SAR86, tenían tasas de respiración extremadamente bajas (<10 amol O2 por célula por hora), mientras que la mayor parte del consumo de O2 podría atribuirse a géneros de baja abundancia (Figuras de datos extendidos). 7 y 8). En conjunto, estos resultados y los del GoM sugieren un desacoplamiento general de las tasas de respiración y la abundancia de células entre los taxones de procarioplancton marino.

Con la excepción de las cianobacterias, generalmente se supone que la heterotrofia acoplada a la respiración de oxígeno es la fuente predominante de energía para el procarioplancton de la superficie del océano. Por lo tanto, nuestro hallazgo de que algunos de los linajes de procarioplancton más abundantes, en particular Pelagibacter y SAR86, tienen tasas de respiración específicas de células in situ extremadamente bajas es desconcertante. Esto plantea interrogantes sobre cómo estos microorganismos mantienen el predominio numérico y no son superados por géneros con tasas de respiración específica de células in situ alrededor de 100 veces más altas, como Planktomarina y ASP10-02a, y cómo estos hallazgos pueden reconciliarse con informes anteriores de tasas de respiración específicas de células in situ relativamente altas. tasas in situ de duplicación celular, síntesis de proteínas y absorción de sustrato por Pelagibacter28.

Nuestro hallazgo de tasas de respiración consistentemente bajas entre todas las células de Pelagibacter y SAR86 analizadas en todas las fechas y ubicaciones de recolección de muestras (Fig. 2 y datos extendidos, Figs. 4, 7, 8 y 10) contradice las hipótesis anteriores de crecimiento desenfrenado de algunos ecotipos de Pelagibacter que se adaptan a las condiciones locales29. El tamaño pequeño de las células puede proporcionar una explicación parcial de su respiración mínima. Las células de los géneros Pelagibacter, AAA076-P13 y D2472 promediaron alrededor de 0,3 µm de diámetro, mientras que el diámetro de Planktomarina, Amylibacter, LFER01 y ASP10-02a promedió 0,5–0,8 µm (Tabla complementaria 4). Suponiendo una forma celular similar, una diferencia doble en el diámetro se traduce en una diferencia ocho veces mayor en el biovolumen. Esto es sustancial, pero no suficiente para explicar las discrepancias mucho mayores en las tasas de respiración específicas de las células. Además, observamos solo una correlación débil entre el volumen de una célula y la tasa de respiración (Fig. 3a). En cambio, las tasas de respiración basadas en RSG se correlacionaron más fuertemente con el tiempo mínimo de duplicación previsto por el genoma30 (Fig. 3b), lo que sugiere que las tasas de crecimiento de muchos géneros estaban cerca de su máximo teórico en las muestras de GoM analizadas. Curiosamente, no encontramos correlación entre la respiración y la frecuencia de células que contienen ADN viral entre géneros, ni diferencias en las tasas de respiración SAR86 entre fechas con fracción alta (octubre de 2018) y baja (julio de 2019) de células que contienen virus (Datos extendidos Fig. 3e), que argumenta en contra de que las interacciones fago-huésped tengan un impacto importante en las tasas de respiración de procarioplancton específicas de células.

a, Tasa de consumo de O2 promedio ponderado versus biovolumen. b, Tasa de consumo de O2 promedio ponderado versus tiempo mínimo de duplicación. c, Biovolumen frente al recuento de transcritos del gen 16S rRNA. d, Tasa de consumo de O2 promedio ponderado versus el recuento de transcritos del gen 16S rRNA. e, Tasa de consumo de O2 promedio ponderado frente al recuento de transcritos de ARNm. Para a–d, cada punto de datos representa un valor promedio calculado para cada género y muestra de campo. Las líneas sólidas indican regresiones y las líneas punteadas indican valores medianos. Tenga en cuenta que las tasas de consumo de O2 ponderadas tienen en cuenta las celdas que caen por debajo del límite de detección RSG, como se describe en los Métodos.

Para obtener información adicional sobre la fisiología del procarioplancton del GoM, generamos conjuntos de datos metatranscriptómicos cuantitativos31 a partir de cuatro de las muestras analizadas. Las lecturas individuales se anotaron utilizando GoM SAG como base de datos de referencia3 y se normalizaron a transcripciones por celda. Los recuentos promedio generales de ARNm y transcritos de genes de ARNr 16S por célula fueron 36 y 426, lo que es similar a los informes anteriores sobre el procarioplancton costero32. Sin embargo, nuestro estudio mostró que estos recuentos variaban ampliamente entre los géneros de procarioplancton, con un rango de 5 a 144 por célula para mRNA y de 48 a 2480 por célula para rRNA. Observamos una correlación entre el tamaño de la célula y el número de copias de la transcripción de ARNr (Fig. 3c), pero no hubo correlaciones significativas entre las tasas de respiración específicas de la célula y los recuentos de moléculas de ARNr o ARNm (Fig. 3d,e), que a veces se utilizan como indicadores de la actividad metabólica33,34. Además, los recuentos por biovolumen de ARNr fueron relativamente uniformes entre los géneros y diferían solo en tres veces entre Pelagibacter y Planktomarina. Esto sugiere que los recuentos de moléculas de ARNm total y ribosomal son malos indicadores de la respiración celular y que los procesos de producción de energía distintos de la respiración pueden ser importantes para el metabolismo del procarioplancton de GoM.

La fototrofia basada en proteorrodopsina es una fuente complementaria de la síntesis de ATP35, cuyo potencial de codificación está muy extendido en el procarioplancton marino3,5,6,7, incluida la mayoría de los géneros del GoM (Tabla complementaria 4). Por lo tanto, algunos linajes de procarioplancton pueden ser mixótrofos que dependen de una combinación de procesos heterótrofos y fototróficos como fuentes de energía. Un estudio reciente de la distribución de pigmentos en el mar Mediterráneo indicó que la proteorrodopsina captura una cantidad similar de energía solar que la clorofila a, lo que puede ser suficiente para mantener el metabolismo basal de una célula de procarioplancton promedio36. Aunque es bien sabido que Pelagibacter y otros grupos predominantes de procarioplancton oceánico superficial consumen compuestos orgánicos simples20,28,37, el acceso a ATP derivado de la proteorrodopsina puede aumentar el uso de estas moléculas en la biosíntesis en lugar de la respiración, aumentando así la eficiencia del crecimiento19,38 ,39. Sin embargo, falta evidencia directa de la importancia de la proteorrodopsina en la energía celular del procarioplancton in situ y en los procesos biogeoquímicos del océano5,6. Aquí encontramos que los recuentos por célula de transcritos de proteorrodopsina se encontraban entre los más altos en taxones con algunas de las tasas de respiración detectables más bajas, incluidos Pelagibacter y SAR86, a pesar de sus pequeños tamaños de celda (Fig. 4a). Dada la racionalización extrema de los genomas y el metabolismo de Pelagibacter y SAR8637, la abundancia de transcritos de proteorrodopsina constituye un fuerte indicio de la importancia de la fototrofia para estos linajes predominantes de procarioplancton.

a, La relación entre las tasas de respiración específicas de las células y los recuentos de transcritos de proteorrodopsina entre géneros. Cada punto de datos representa un género y una sola muestra de campo. Los colores y las formas se definen en la Fig. 3. b, Esquema de las funciones complementarias de la respiración y la fototrofia de proteorrodopsina en la generación de gradiente de protones y ATP en el procarioplancton. c, d, Tamaños de celda, tasas de respiración y afiliaciones taxonómicas de células individuales de procarioplancton recolectadas en GoM durante agosto de 2021 por la noche (c) y durante el día (d). Tenga en cuenta que las estimaciones de respiración específicas del género tienen en cuenta las celdas que se encuentran por debajo del límite de detección RSG, como se describe en los Métodos.

Estudios previos han demostrado un metabolismo diferencial del procarioplancton entre el día y la noche, incluido un ciclo diurno de expresión génica para transportadores40 y proteorrodopsinas41. Todos los experimentos RSG descritos anteriormente se realizaron a media mañana, cuando los recuentos de transcritos de proteorrodopsina pueden ser mayores41. Para examinar el impacto potencial de la fototrofia de la proteorrodopsina en las tasas de respiración, realizamos experimentos adicionales de sondeo RSG y genómica unicelular en el procarioplancton del GoM durante el día y la noche en agosto de 2021. Presumimos que los heterótrofos obligados aumentan sus tasas de respiración durante el día, cuando las algas la fotosíntesis aumenta la disponibilidad de sustratos orgánicos lábiles. Por el contrario, se puede esperar que los fotótrofos procarióticos no cianobacterianos respiren más durante la noche para compensar la ausencia de la bomba de protones impulsada por proteorrodopsina (Fig. 4b). De acuerdo con el primer escenario, el género UBA10364 (Bacteroidota, Flavobacteriales) exhibió tasas de respiración más altas durante el día en comparación con la noche (Fig. 4c, d, Datos extendidos, Figs. 9 y 10). Por el contrario, las tasas de respiración de AA076-P13 (SAR86) fueron seis veces más altas (52 frente a 8 amol O2 por célula por hora) durante la noche en comparación con el día (prueba U de Mann-Whitney, P < 0,05; datos ampliados Figs. 9 y 10), lo que sugiere un efecto potencial de la fototrofia en el metabolismo energético de este género. Se ha demostrado previamente que los linajes SAR86 tienen un conjunto diverso de genes de proteorrodopsina42,43, que pueden usar para complementar la energía producida por la respiración. La reducción diurna en la respiración de AA076-P13 en 44 amol O2 por célula por hora implica que se puede haber generado una cantidad comparable de ATP utilizando el gradiente de protones impulsado por proteorrodopsina. Sin embargo, la respiración de Pelagibacter fue similar durante el día y la noche, alrededor de 5 amol O2 por célula por hora. Múltiples factores pueden haber enmascarado el impacto total de la fototrofia de la proteorrodopsina en las fuentes de energía del procarioplancton en nuestro experimento, incluyendo (1) la estimulación de la respiración por los productos de la fotosíntesis durante el día; (2) una capacidad limitada de algunos géneros para regular su metabolismo, incluido Pelagibacter37; (3) eficiencia de crecimiento variable; y (4) poder estadístico insuficiente debido a la pequeña escala de este experimento. Al hacer una suposición especulativa de que el impacto promedio en toda la comunidad de las bombas de protones impulsadas por proteorrodopsina es equivalente a 44 amol O2 por célula por hora durante 12 horas al día, podemos estimar que el procarioplancton del GoM está usando proteorrodopsinas para generar el ATP equivalente al generado de 0,5 µmol O2 por l por día, un orden de magnitud menos que la respiración total del procarioplancton. Se espera que la importancia de la fototrofia de la proteorrodopsina sea mucho mayor en entornos oligotróficos marinos38, en los que las tasas de respiración de menos de 10 amol O2 por célula por h son típicas de la mayoría de las células de procarioplancton (Datos ampliados, Figs. 7 y 8) y la proteorrodopsina puede absorber una cantidad de luz solar comparable a la clorofila a36. En las regiones productivas, el acceso relativamente constante al ATP derivado de la proteorrodopsina puede mitigar el impacto de las diferencias estacionales en la productividad del fitoplancton en el procarioplancton, lo que ayuda a explicar la estacionalidad limitada en la composición del procarioplancton del GoM (Fig. 2c–e y Datos extendidos Fig. 4).

Los análisis integrados de genoma y fenotipo de células individuales no cultivadas revelaron que las tasas de respiración específicas de las células difieren en más de 1000 veces entre los géneros de procarioplancton marino. Descubrimos que, aunque la mayoría de la respiración la realizan linajes relativamente raros, los taxones de procarioplancton más abundantes tienen tasas de respiración extremadamente bajas, lo que cuestiona la fuente de su ventaja competitiva. El desacoplamiento de las tasas de respiración y la abundancia del linaje, los recuentos elevados de transcritos de proteorrodopsina en células de baja respiración y la respiración elevada de algunos de los taxones de baja respiración durante la noche indican colectivamente que la fototrofia basada en proteorrodopsina puede aumentar la eficiencia del crecimiento y la productividad de las células predominantes. grupos de procarioplancton, ya sea proporcionando energía para la absorción de nutrientes o impulsando la biosíntesis de biomoléculas, lo que tiene como resultado un impacto posterior en los flujos de carbono y energía en la superficie del océano.

Según el fabricante (Thermo Fisher Scientific), las oxidorreductasas convierten la RSG en un producto verde fluorescente dentro de las células vivas, que se puede cuantificar mediante microscopía o citometría de flujo. En comparación con una sonda de tetrazolio CTC44 funcionalmente similar y utilizada anteriormente, RSG tiene propiedades espectrales de fluorescencia superiores, un tiempo de incubación más corto y sin efectos tóxicos conocidos11. El manual del kit BacLight RedoxSensor Green Vitality (Thermo Fisher Scientific) recomienda una incubación de la muestra de 10 minutos con RSG antes de continuar con los análisis celulares. Para evaluar el impacto de la duración de la incubación en la abundancia y la intensidad de la fluorescencia de las células de procarioplancton marino, realizamos una prueba en agua de mar recolectada en la costa del GoM (43.8609° N, 69.5782° W) el 11 de agosto de 2016. Se recolectaron dos muestras de agua de mar superficiales duplicadas en tubos de polipropileno estériles de 50 ml y transportados al laboratorio a temperatura in situ para su posterior procesamiento. Estas muestras se modificaron con la concentración recomendada por el fabricante de RSG (concentración final de 1 µM) y se incubaron a temperatura in situ en la oscuridad durante un período de tiempo variable antes de analizarlas con el citómetro de flujo BD Influx Mariner (Becton Dickinson, anteriormente Cytopeia) equipado con un láser de 488 nm para la excitación y un orificio de boquilla de 70 μm. Las células positivas para RSG se seleccionaron en función de la fluorescencia verde de partículas (paso de banda 531/40), la dispersión frontal y la proporción de fluorescencia verde versus roja (paso de banda 692/40; para una mejor discriminación de las células de las partículas detríticas). Descubrimos que tanto la abundancia como la intensidad de fluorescencia de las células positivas para RSG alcanzaron sus valores máximos y se mantuvieron estables después de 30 a 70 minutos de incubación (Datos extendidos, Fig. 3f). Sobre la base de estos resultados, las incubaciones posteriores de RSG se programaron durante 30 min.

Los aislados de especies fenotípicamente distintas, Shewanella loihica45, Roseobacter denitrificans46, Pseudomonas stutzeri47, Ruegeria pomeroyi48 y Vibrio alginolyticus49, se adquirieron del Centro Nacional de Algas Marinas y Microbiota. Los aislados de Rhodoluna lacicola50 y Oligotropha carboxidovorans51 se obtuvieron de la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares. Los cultivos se cultivaron en medios específicos a diferentes temperaturas y concentraciones de nutrientes (las recetas de medios y las condiciones de crecimiento se proporcionan en la Tabla complementaria 1) en viales de suero de vidrio de 70 ml sellados con tapones de goma de butilo con aire atmosférico en el espacio de cabeza (concentración inicial de O2 21%) en una mesa agitadora giratoria para facilitar el intercambio de gases completo entre el medio de cultivo y el espacio de cabeza del recipiente. Se utilizó un enfoque de espacio de cabeza debido a la necesidad de retirar pequeños volúmenes de fluidos en puntos de tiempo discretos.

La concentración de oxígeno en todos los recipientes de cultivo se midió utilizando el medidor óptico Firesting-O2 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (tecnología de sensores PyroScience). Para cada botella de suero, la sonda optode se insertó en el espacio de cabeza con la sonda de normalización de temperatura también insertada en un espacio de cabeza de botella diferente (con agua de mar en la fase líquida) mantenido a la misma temperatura que el cultivo sometido a análisis. La concentración de oxígeno se midió en el espacio de cabeza y se convirtió en concentración de oxígeno disuelto en el medio de cultivo, suponiendo un equilibrio de gas completo entre el medio de cultivo y el espacio de cabeza de cultivo (ya que todos los cultivos se mantuvieron en una mesa de agitación giratoria) y teniendo en cuenta la temperatura, el espacio de cabeza presión y salinidad del medio de cultivo52. Esta conversión fue posible gracias al método optode Firesting-O2 de medir directamente el O2 en la punta de la sonda optode (es decir, no hay difusión ni consumo de O2 a través de este método). Después de medir el O2 en el espacio de cabeza, se calculó la concentración presente en el medio de cultivo mediante la técnica de equilibrio del espacio de cabeza y se calculó53 utilizando los coeficientes de Bunsen54,55 para O2, que tiene en cuenta la temperatura y la salinidad a presión atmosférica constante a nivel del mar. Las concentraciones de O2 en el medio de cultivo se midieron cada pocas horas sobre la base del tiempo de duplicación estimado de cada tipo de cultivo. Las mediciones de la concentración de O2 para cada cultivo abarcaron la inoculación inicial a través de la fase logarítmica de crecimiento hasta que se alcanzó la fase estacionaria. Los cambios operativos en la abundancia de células microbianas se determinaron sobre la base de mediciones de densidad óptica a una longitud de onda de 600 nm usando un espectrofotómetro. Se determinó que un cultivo estaba en la fase estacionaria una vez que la concentración de O2 dejó de disminuir exponencialmente y cuando la abundancia de células dejó de aumentar exponencialmente. Durante la fase estacionaria, las tasas de respiración de O2 se calcularon como diferencias normalizadas en el tiempo en la concentración de O2 entre mediciones. Para estimar las tasas de respiración de O2 por célula promedio, se determinó la abundancia de células microbianas mediante análisis de citometría de flujo de submuestras del material de cultivo tomadas al mismo tiempo que se midieron las concentraciones de O2, como se describe a continuación.

Una vez que los cultivos alcanzaron la fase estacionaria, se extrajeron submuestras de 1 ml con una aguja y una jeringa estériles, se transfirieron a un criovial de 2 ml y se modificaron con 1 µl de solución madre RSG. Después de una mezcla suave, los crioviales se incubaron durante 30 min a la misma temperatura que sus cultivos de origen. Luego, los crioviales se modificaron con glicerol al 5 % y tampón Tris-EDTA 1 × pH 8 (concentraciones finales), se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C hasta su uso posterior en el análisis de citometría de flujo. Después de tomar las muestras incubadas con RSG y mientras el cultivo aún estaba en la fase estacionaria, se prepararon controles muertos para cada tipo de cultivo esterilizando en autoclave 10 ml de cultivo y medio durante 30 min a 121 °C. También se tomaron muestras de medio no inoculado y controles muertos para determinar las puertas apropiadas para el análisis de citometría de flujo aguas abajo.

Después de descongelar, las muestras crioconservadas se analizaron utilizando el citómetro de flujo ZE5 Cell Analyzer (Bio-Rad). Las muestras se analizaron con excitación azul (488 nm) y el instrumento se disparó tanto con dispersión frontal como con fluorescencia verde utilizando un filtro de paso de banda de 525/35 nm. La puerta de análisis se definió sobre la base de la fluorescencia verde de partículas (RSG) y la dispersión lateral en ángulo recto. Las puertas de análisis se configuraron para eliminar áreas que contenían solo ruido de partículas no celulares de medios en blanco sin inocular, y también eliminando áreas que contenían células muertas (matadas por autoclave). Para todas las muestras de cultivo, se definió claramente un área de células en crecimiento (Datos extendidos Fig. 2b). La abundancia de células y la fluorescencia verde se analizaron en FlowJo v.10.6.2 (Becton Dickinson).

Para tener en cuenta la deriva diaria y las diferencias entre los instrumentos y configuraciones de citometría del citómetro de flujo ZE5 Cell Analyzer (Bio-Rad) y el citómetro de flujo BD Influx Mariner (Becton Dickinson, anteriormente Cytopeia), se desarrolló un procedimiento para normalizar fluorescencia utilizando uno de los dos kits estándar de tamaño de partículas fluorescentes: NFPPS-52-4K o RCP-30-5A (Spherotech). Estas perlas se analizaron usando citometría de flujo cada día cuando se analizaron las células marcadas con RSG, usando el mismo instrumento y configuración. Para cada perla, se calculó la media geométrica de la fluorescencia 525/35 utilizando FlowJo. Para el kit de perlas NFPPS-52-4K, a la perla menos fluorescente se le asignó un valor de fluorescencia normalizado igual a 1 y los valores de fluorescencia normalizados de las otras perlas (Tabla complementaria 5) se calcularon como la proporción promedio de su fluorescencia en relación con la fluorescencia de la perla menos fluorescente. Los promedios de estas proporciones se estimaron a partir de la aplicación de esta técnica en varios días.

Para cada día de análisis de muestras de cultivo y de campo, se realizó una regresión lineal para establecer la relación entre la fluorescencia de las perlas medida y sus valores de fluorescencia normalizados. Luego, la fluorescencia normalizada de cada celda se estimó de la siguiente manera:

donde x es la fluorescencia medida de una célula, m es la pendiente determinada experimentalmente de la regresión lineal de la perla desde el día del análisis celular y b es la intersección determinada experimentalmente de la regresión lineal de la perla desde el día del análisis celular.

Para intercalibrar los dos conjuntos de perlas, se coanalizaron por citometría de flujo en varios días en el citómetro de flujo BD Influx Mariner y se calculó la fluorescencia normalizada de la media geométrica de cada perla RCP-30-5A utilizando la ecuación de regresión lineal descrita anteriormente. Se calculó un valor de fluorescencia normalizado estandarizado promediando la media geométrica de las perlas RCP-30-5A de varios días (Tabla complementaria 5 (columna RCP-30-5A)). La fluorescencia normalizada estandarizada de las perlas RCP-30-5A se usó para realizar un análisis de regresión lineal para establecer la relación entre la fluorescencia medida de las perlas y su fluorescencia normalizada (ver arriba) en los días en los que las perlas NFPPS-52-4K no estaban disponible.

Posteriormente, correlacionamos la fluorescencia normalizada de los cultivos microbianos con su tasa de respiración promedio (Fig. 1a), lo que resultó en la siguiente relación exponencial:

donde la respiración celular es la estimación de la respiración específica de la célula en fmol O2 por célula por hora y la fluorescencia normalizada es la fluorescencia RSG normalizada de la célula (ver arriba). Esta ecuación se transformó para facilitar la interpretación en la Fig. 1a.

Para validar el uso de RSG en la cuantificación de la respiración, realizamos mediciones simultáneas de sondeo de RSG y respiración a granel utilizando la metodología tradicional de Winkler14 en muestras de procarioplancton costeras y de mar abierto geográficamente diversas en condiciones in situ (Tabla complementaria 2). Para las muestras de GoM, se recolectó agua de mar a una profundidad de 1 m usando una botella Niskin en el mismo lugar que las muestras RSG descritas anteriormente, excepto por una muestra (río Damariscotta), cuya ubicación se proporciona en la Tabla complementaria 2. El agua de mar se recolectó, se pasó a través de un filtro de malla de 40 µm y se usó para llenar ocho botellas de demanda biológica de oxígeno (DBO) sin espacio de cabeza. Cada matraz se desbordó al menos 3 veces su volumen para evitar burbujas de aire y omitir cualquier intercambio gaseoso adicional que el agua hubiera tenido con la atmósfera durante la transferencia al recipiente. Cuatro de estas botellas se fijaron inmediatamente56, mientras que las cuatro botellas restantes se incubaron a temperatura in situ en la oscuridad durante 24 h antes de la fijación56. La concentración de oxígeno en todas las botellas se analizó utilizando un valorador amperométrico56.

Las muestras de mar abierto se recogieron directamente de las botellas Niskin en matraces de DBO, mientras que las muestras del mar Mediterráneo costero se recogieron con baldes desde la orilla y se transfirieron a garrafas de policarbonato limpiadas con ácido. Una vez en el laboratorio, el agua del mar Mediterráneo costero se filtró a través de filtros de policarbonato de 0,8 µm y se transfirió a matraces de DBO. Cada matraz se desbordó al menos tres veces su volumen. Los tres matraces de DBO duplicados se fijaron inmediatamente y otros tres matraces se incubaron en la oscuridad a temperatura in situ durante 24 h. Después de la fijación con los productos químicos de Winkler, las muestras se midieron utilizando el método potenciométrico56 (Mediterráneo costero y Atlántico norte) o espectrofotometría57 (Atlántico sur y ecuatorial). Las tasas de respiración de procarioplancton basadas en Winkler se estimaron como la diferencia en la concentración de oxígeno disuelto entre las muestras inicial y final.

Inmediatamente después de recolectar la muestra de campo, las submuestras se incubaron con RSG a temperatura in situ en la oscuridad durante 30 min, luego se almacenaron a -80 °C hasta los análisis de citometría de flujo y las estimaciones de las tasas de respiración específicas de las células como se describe anteriormente. Las tasas de respiración a granel basadas en RSG se obtuvieron multiplicando las tasas de respiración promedio específicas de las células (descritas anteriormente) por la abundancia de células que respiran en cada muestra.

Para el estudio principal, se recolectaron muestras del GdM del muelle del Laboratorio Bigelow de Ciencias Oceánicas en la costa de East Boothbay en la desembocadura del río Damariscotta (43.8609° N, 69.5782° W) durante seis días desde abril de 2017 hasta julio de 2017. 2019 (Cuadro complementario 2). Las muestras de agua se recolectaron a una profundidad de 1 m con una botella Niskin de 5 l, se pasaron por un filtro de malla de 50 µm, se transfirieron a botellas de policarbonato lavadas con ácido, se transportaron al laboratorio a temperatura in situ y se procesaron de inmediato. Las muestras de mar abierto se recogieron con botellas Niskin de 12 l unidas a una roseta CTD y se transfirieron a botellas de policarbonato lavadas con ácido. Posteriormente, se transfirieron submuestras duplicadas de 1 ml de agua de mar a crioviales, modificadas con 1 µl de RSG (concentración final de 1 µM), incubadas en la oscuridad a temperatura in situ durante 30 min, modificadas con glicerol al 5 % y tampón TRIS-EDTA 1× pH 8 (concentraciones finales), ultracongelado en N2 líquido y almacenado a -80 °C. En todos los casos, se modificaron submuestras adicionales de 1 ml de agua de mar con glicerol al 5 % y tampón TRIS-EDTA 1 × pH 8 (concentraciones finales), se congelaron instantáneamente en N2 líquido y se almacenaron a -80 °C sin adición de RSG.

Para comparar las condiciones diurnas y nocturnas, se recolectaron muestras adicionales de agua de mar del GoM del muelle del Laboratorio Bigelow de acuerdo con los mismos procedimientos descritos anteriormente el 24 (14:00 EST) y el 25 (02:00 EST) de agosto de 2021. Triplicar alícuotas de 1 ml de muestra se marcaron con RSG y se crioconservaron como se describe anteriormente.

Para clasificar las células que respiran, usamos muestras que se etiquetaron con RSG en el campo, como se describe anteriormente. Para la clasificación no específica de las células de procarioplancton, las muestras de agua de mar criopreservadas y descongeladas se incubaron con la tinción de ácido nucleico SYTO 9 (concentración final de 5 µM; Thermo Fisher Scientific) en hielo durante 10 a 60 minutos. El análisis y clasificación de citometría de flujo se realizó utilizando un citómetro de flujo BD InFlux Mariner equipado con un láser de 488 nm para excitación y un orificio de boquilla de 70 μm (Becton Dickinson, anteriormente Cytopeia). El citómetro se activó con dispersión frontal en la mayoría de los casos y con fluorescencia verde en agosto de 2021. Se utilizó el modo 'una sola gota' para obtener la máxima pureza de clasificación. La puerta de clasificación se definió en función de la fluorescencia verde de partículas (proxy del contenido de ácido nucleico o la tasa de respiración), la dispersión frontal (proxy del diámetro celular) y la proporción de fluorescencia verde frente a roja (para una mejor discriminación de las células de las partículas detríticas). Las células se depositaron en microplacas de 384 pocillos que contenían 600 nl por pocillo de tampón TE 1x y se almacenaron a -80 °C hasta su posterior procesamiento. De los 384 pocillos, 317 pocillos se dedicaron a células individuales, 64 pocillos se usaron como controles negativos (sin deposición de gotitas) y 3 pocillos recibieron 10 células cada uno para servir como controles positivos. La precisión de la deposición de gotas en los pocillos de la microplaca se confirmó varias veces durante cada día de clasificación mediante la clasificación de partículas fluorescentes arcoíris SPHERO de 3,46 µm de diámetro (Spherotech) y examinando su presencia en el fondo de cada pocillo mediante microscopía. En estos exámenes, menos del 2 % de los pocillos no contenían perlas y <0,4 % de los pocillos contenían más de una perla.

Los datos de clasificación de índice se recopilaron utilizando el software BD Sortware. Los siguientes cultivos de laboratorio se utilizaron en el desarrollo de una curva de calibración equivalente al diámetro celular: Prochlorococcus marinus CCMP 2389; Microbacterium sp.; Pelagibacter ubique HTCC1062; y Synechococcus CCMP 2515. Los diámetros celulares medios de estos cultivos se determinaron utilizando el contador Multisizer 4e Coulter (Beckman Coulter). La dispersión frontal promedio de cada uno de los cuatro cultivos se determinó utilizando la misma configuración de citometría de flujo utilizada durante la clasificación de muestras ambientales, repetida cada día de clasificación de células individuales. Observamos una fuerte correlación entre los diámetros de las células y la dispersión frontal (FSC) entre estos cultivos16. Aprovechando esta correlación, se estimó el diámetro estimado de las celdas ambientales ordenadas (diámetro, en µm) a partir de un modelo de regresión lineal logarítmica:

donde a y b son coeficientes de regresión derivados empíricamente de cada día de clasificación16, y FSC es la dispersión frontal medida. Este cálculo se repitió para todas las sesiones de clasificación de células de citometría de flujo. El volumen de la celda proxy se calculó asumiendo una forma esférica para todos los linajes.

Antes de la amplificación del ADN genómico, las células se lisaron y su ADN se desnaturalizó mediante dos ciclos de congelación y descongelación y la adición de 700 nl de un tampón de lisis que constaba de KOH 0,4 M, EDTA 10 mM y ditiotreitol 100 mM, y una incubación posterior de 10 min a temperatura ambiente. 20 °C. La lisis se terminó mediante la adición de 700 nl de Tris-HCl 1 M, pH 4. La amplificación del genoma completo de una sola célula se realizó usando WGA-X16. En resumen, las reacciones WGA-X de 10 µl contenían concentraciones finales de 0,2 U µl−1 de polimerasa Equiphi29 (Thermo Fisher Scientific), 1 × tampón de reacción Equiphi29 (Thermo Fisher Scientific), 0,4 µM cada uno de dNTP (New England BioLabs), 10 µM ditiotreitol (Thermo Fisher Scientific), heptámeros aleatorios 40 µM con dos enlaces de nucleótidos fosforotioados en el extremo 3′ (Integrated DNA Technologies) y SYTO 9 1 µM (Thermo Fisher Scientific). Estas reacciones se realizaron a 45 °C durante 12–16 h, luego se inactivaron mediante una incubación de 15 min a 75 °C. Para evitar que las reacciones de WGA-X se contaminaran con ADN no diana, todos los reactivos de lisis celular y amplificación de ADN se trataron con luz ultravioleta en un sistema Stratalinker (Stratagene)58. Se realizó una optimización empírica de la exposición ultravioleta para determinar la duración de la exposición ultravioleta necesaria para entrecruzar todos los contaminantes detectables sin inactivar la reacción. La clasificación de células, la lisis y la configuración de WGA-X se realizaron en un entorno con filtro HEPA conforme a las especificaciones de sala limpia Clase 1000. Antes de la clasificación de las células, el instrumento, los reactivos y el espacio de trabajo se descontaminaron para detectar ADN utilizando radiación ultravioleta y solución de hipoclorito de sodio59. Para reducir aún más el riesgo de contaminación del ADN y mejorar la precisión y el rendimiento, se utilizaron manipuladores de líquidos robóticos Bravo (Agilent Technologies) y Freedom Evo (Tecan) para todo el manejo de líquidos en placas de 384 pocillos.

Las bibliotecas para la secuenciación genómica SAG se crearon con reactivos Nextera XT (Illumina) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, excepto los pasos de purificación, que se realizaron con kits de limpieza de columnas (QIAGEN) y la selección del tamaño de la biblioteca, que se realizó con BluePippin (Sage Science ) con un tamaño objetivo de 500 ± 50 pb. Las mediciones de la concentración de ADN se realizaron utilizando los kits de ensayo Quant-iT dsDNA (Thermo Fisher Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las bibliotecas se secuenciaron con el sistema NextSeq 500 (Illumina) en modo 2 × 150 pb o con el sistema NextSeq 2000 (Illumina) en modo 2 × 100 pb. Las lecturas de secuencia obtenidas se recortaron en calidad utilizando Trimmomatic (v.0.32)60 con la siguiente configuración: -phred33 LEADING:0 TRAILING:5 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:36. Se eliminaron las lecturas que coincidían con el ensamblaje de referencia de Homo sapiens GRCh38 y una base de datos local de contaminantes reactivos WGA-X16 (≥95 % de identidad de ≥100 pb alineaciones), así como las lecturas de baja complejidad (que contenían <5 % de cualquier nucleótido). Las lecturas restantes se normalizaron digitalmente usando kmernorm v.1.05 (http://sourceforge.net/projects/kmernorm) usando la configuración -k 21 -t 30 -c 3 y luego ensambladas con SPAdes (v.3.0.0)61 usando los siguientes ajustes: --careful --sc --phred-offset 33. Cada extremo de los contigs obtenidos se recortó en 100 pb y solo se retuvieron los contigs de más de 2000 pb. Se eliminaron los cóntigos que coincidían con el ensamblaje de referencia de H. sapiens GRCh38 y una base de datos local de contaminantes reactivos WGA-X16 (≥95 % de identidad de ≥100 alineaciones de pb). La calidad de los ensamblajes del genoma resultantes se determinó mediante CheckM (v.1.0.7)62 y análisis de frecuencia de tetrámeros63. Este flujo de trabajo se evaluó en busca de errores de ensamblaje utilizando tres cultivos de referencia bacterianos con complejidad genómica y porcentaje de GC diversos, lo que indica que no hay bases indefinidas y no objetivo en los ensamblajes y las siguientes frecuencias promedio de ensamblajes erróneos, indeles y discrepancias por 100 kb: 1.5, 3.0 y 5.0, respectivamente (ref. 16). Los 153 SAG en los que se detectaron secuencias de ADN potencialmente contaminantes se eliminaron del conjunto de datos. Esto dio como resultado 7.518 ensamblajes de genoma SAG seleccionados.

La identidad de aminoácidos promedio SAG por pares se estimó utilizando CompareM64. Las regiones del gen 16S rRNA de más de 500 pb se identificaron mediante alineaciones locales proporcionadas por BLAST contra la base de datos de referencia SILVA seleccionada por CREST65 SILVAMod (v.128)66 y se clasificaron mediante una reimplementación del algoritmo del último ancestro común de CREST. Los árboles filogenéticos se generaron a partir de genes SAG 16S rRNA casi completos (>1400 pb) produciendo primero alineaciones usando el alineador SINA (v.1.2.11)67 y luego infiriendo relaciones filogenéticas de máxima probabilidad en MEGACC (v.10.2.4) 68 con 100 arranques. Los árboles fueron anotados y visualizados en iTOL69. Las asignaciones taxonómicas de los SAG se obtuvieron con GTDB-Tk (v.1.4.1)70.

La anotación funcional se realizó por primera vez utilizando Prokka71 con las bases de datos Swiss-Prot predeterminadas proporcionadas por el software. Prokka se ejecutó por segunda vez con una base de datos de anotación de proteínas personalizada construida a partir de la compilación de entradas Swiss-Prot72 para Archaea y Bacteria. Las asignaciones taxonómicas se obtuvieron utilizando GTDB-Tk (v.1.4.1)70. Las secuencias virales (contigs completos o parciales) se identificaron de forma independiente utilizando tres herramientas de identificación viral bioinformática preexistentes: ViruScope73 (virus_prob > 0,95), VirSorter274 (solo categoría 1 y 2) y DeepVirFinder75 (P > 0,95). Los resultados de estas tres herramientas se combinaron. Los falsos positivos (P < 0,95) se eliminaron mediante CheckV76.

La biomasa microbiana de alícuotas de 100-200 ml de agua de mar se recolectó en filtros esterilizados Supor de 0,2 µm (Pall Corporation) mediante filtración al vacío (presión máxima de 15 psi), luego se congeló rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 °C hasta la extracción del ácido nucleico. . Se agregaron estándares de ARN MTST5 y MTST6 a cada filtro antes de la extracción de ARN a una concentración estimada de 0,1 a 1 % de rendimiento total, como se describió anteriormente31. El ADN y el ARN se extrajeron en paralelo con el kit Zymobiomics DNA/RNA Miniprep (Zymo Research) y se almacenaron a -80 °C hasta su posterior procesamiento. Las muestras de ARN se limpiaron y concentraron aún más utilizando el kit RNA Clean & Concentrator (Zymo Research). Las bibliotecas de cDNA para la secuenciación de escopeta de Illumina se generaron con KAPA RNA HyperPrep (Roche Sequencing). Las bibliotecas para la secuenciación rápida de ADN se generaron utilizando el kit Nextera XT (Illumina) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Ambos tipos de biblioteca se seleccionaron por tamaño con BluePippin (Sage Science) configurado para 370 pb 'apretados' y se cuantificaron utilizando Tapestation (Agillent). Estas bibliotecas se secuenciaron utilizando el sistema NextSeq 500 (Illumina) en modo 2 × 150 pb.

Después de la secuenciación, las lecturas de las bibliotecas de ARN y ADN se recortaron inicialmente con Trimmomatic (configuración: -phred33 LEADING:0 TRAILING:5 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:75). Se eliminaron las lecturas que coincidían con el ensamblaje de referencia de H. sapiens GRCh38 y una base de datos local de contaminantes del reactivo WGA-X16 (≥95 % de identidad de ≥100 pb alineaciones), así como las lecturas de baja complejidad (que contenían <5 % de cualquier nucleótido). Las lecturas restantes se fusionaron con bbmerge usando la siguiente configuración: k = 40, extend2 = 60, iteraciones = 5, loose='t', qtrim2='t'. Las lecturas combinadas se anotaron taxonómica y funcionalmente utilizando el clasificador Kaiju77, después de reemplazar la base de datos del genoma de referencia subyacente con SAG de este estudio como se describió anteriormente3. Para identificar las transcripciones del gen SSU rRNA, las lecturas metatranscriptómicas se mapearon en la biblioteca SILVA SSU66 (v.132) utilizando Bowtie278 con una identidad del 95 % a lo largo de la lectura. La abundancia de cada género en una muestra (GAi; células por ml) se calculó de la siguiente manera:

donde e es un factor de normalización para géneros que no generaron SAG, y se define como:

donde ai es el conteo de lecturas del metagenoma reclutadas para el género i SAG, bi es la fracción promedio de nucleótidos en ensamblajes del género i SAG que codifican proteínas, c es el conteo total de lecturas en el metagenoma, di es el tamaño promedio estimado del genoma del género i SAG y f es la abundancia total de procarioplancton, en células por ml. Este cálculo se repitió para cada día de muestreo.

El recuento promedio de transcritos por célula (TCi) se calculó para cada género y gen de la siguiente manera:

donde ai es el recuento de lecturas mapeadas en el gen de interés, b es el número de transcritos de ARN de MTST5 y MTST6 agregados a la muestra, c es el número de lecturas mapeadas en MTST5 y MTST6, por lo que la relación b/c es el número de transcripciones por lectura, d es el volumen de la muestra recolectada en el filtro en ml y GAii es la abundancia del género (células por ml; ver arriba). Este cálculo se repitió para cada día de muestreo.

La tasa de respiración celular promedio (ACRi; amol O2 por célula por h) de cada género en cada muestra de agua de mar del GoM se estimó de la siguiente manera:

donde R se define como:

donde ai es la tasa de respiración promedio de las células de un género determinado recuperadas en SAG con tasas de respiración estimadas que superan el límite de detección (4 amol O2 por célula por hora), bi es el recuento de SAG clasificados como pertenecientes al género i (es decir, el número de células activas en el género i), c es el recuento de todos los RSG SAG (también conocido como el número de células activas secuenciadas en la muestra), por lo que bi/c es la fracción de células activas en el género i, d es el total concentración de células activas con una tasa de respiración estimada por encima del límite de detección (células por ml; Tabla complementaria 2) y z es igual a la tasa de respiración específica de célula mínima detectada, en amol O2 por célula por h.

La cantidad R es el número de células activas del género i por ml. La cantidad 0,5 × z[GAi − R] es un factor de corrección para las celdas por debajo del límite de detección. Debido a las diferentes sensibilidades de los métodos de medición, era posible que R fuera ocasionalmente ligeramente mayor que GAi. Cuando esto sucedió, R se igualó a GAi haciendo GAi − R = 0. Este cálculo se repitió para cada día de muestreo. Este cálculo solo se realizó para aquellos géneros y muestras para los que se identificaron al menos 3 SAG marcados con RSG.

Para las principales mediciones de concentración de nutrientes, se recolectaron submuestras de 100 ml de agua de mar de GoM de las mismas muestras que se usaron en análisis de respiración y genómica unicelular. Estas muestras se filtraron inmediatamente a través de un filtro de membrana de nucleoporo de 25 mm y 0,4 µm de tamaño de poro (Whatman) y se almacenaron a -80 °C hasta el análisis de NO3-, NO2-, NH4+ y PO43- en un SEAL AA3 (Seal limitada analítica). Además, se recogieron submuestras de agua de mar por triplicado, de 100 ml cada una, de cada muestra de campo y se filtraron al vacío en filtros de microfibra de vidrio (Whatman, GF/F) en 2 h. Cada filtro GF/F se extrajo en 10 ml de acetona al 90 % a -20 °C durante 24–48 h. Los extractos se analizaron en el fluorómetro 10-AU (Turner Designs) antes y después de la adición de 50 µl de HCl al 10 %, y las concentraciones de clorofila y feofitina se determinaron como se describió anteriormente79.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todas las lecturas de metagenoma y metatranscriptoma y los ensamblajes de genoma unicelular >100 kb están disponibles bajo NCBI BioProject PRJNA846736. Todas las lecturas de metagenomas y metatranscriptomas y ensamblajes de genomas unicelulares, incluidos los ensamblajes de genomas 603 <100 kb, están disponibles en Open Science Framework (https://osf.io/r2un6).

Todos los análisis se realizaron utilizando un software de acceso abierto. Los scripts personalizados utilizados para combinar resultados y generar imágenes están disponibles a pedido.

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Agradecemos a B. Thompson, C. Mascena y B. Tupper del Centro de Genómica de Células Únicas del Laboratorio Bigelow de Ciencias Oceánicas por la generación de datos genómicos de células únicas; MA Moran, C. Smith y B. Nowinski por su ayuda para establecer un flujo de trabajo de transcriptómica cuantitativa; MA Moran y S. Giovannoni por sus comentarios sobre el manuscrito; a los capitanes y tripulaciones de los B/V Sarmiento de Gamboa, B/V Ramón Margalef y B/V Atlantis por su apoyo en el mar; K. Ziervogel, K. Dykens y D. Moser por su asistencia en la recolección de muestras durante el AT42-11 a bordo del R/V Atlantis; C. González-Pola y JM Arrieta por ofrecer la oportunidad de participar en sus cruceros. El laboratorio INOCEN (IEO, PI M. Álvarez) asumió el análisis de oxígeno en RADPROF 2018. R. Santiago y A. Massanet por su ayuda en el análisis químico de muestras de Mallorca. Las muestras de agua de mar del GdM se recolectaron en el muelle del Laboratorio Bigelow en East Boothbay y no requirieron un permiso. Se recolectaron muestras de agua de mar de AT42-11 con el consentimiento del Gobierno de Canadá. Este trabajo fue apoyado por premios de la Fundación Nacional de Ciencias de EE. UU. (1826734 para RS, DE, BNO y NJP; 1737017 para BNO; y 1335810 para RS), el proyecto ARTEMIS del Fondo de Ciencias de Austria (FWF) (P28781-B21 para GJH) y por la subvención de la Fundación Simons (827839 a RS).

Estos autores contribuyeron igualmente: Jacob H. Munson-McGee, Melody R. Lindsay

Laboratorio Bigelow de Ciencias Oceánicas, East Boothbay, ME, EE. UU.

Jacob H. Munson-McGee, Melody R. Lindsay, Julia M. Brown, Timothy D'Angelo, Joe Brown, Laura C. Lubelczyk, David Emerson, Beth N. Orcutt, Nicole J. Poulton y Ramunas Stepanauskas

Departamento de Ecología Funcional y Evolutiva, Universidad de Viena, Viena, Austria

Eva Sintes & Gerhard J. Herndl

Instituto Español de Oceanografía-CSIC, Centro Oceanográfico de Baleares, Palma, España

Eva Sintes

Universidad de Purdue, West Lafayette, IN, EE. UU.

paxton tomko

Departamento de Microbiología Marina y Biogeoquímica, Instituto Real de los Países Bajos para la Investigación del Mar (NIOZ), Universidad de Utrecht, Den Burg, Países Bajos

Gerhard J. Herndl

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RS, BNO, NJP, DE y GJH concibieron el estudio y aseguraron la financiación. MRL, TD y ES mantuvieron cultivos y midieron la respiración. JHM-M., MRL, ES, TD, LCL, NJP y RS recolectaron las muestras y generaron los datos. JHM-M., MRL, JMB, TD, JB y PT analizaron los datos. JHM-M., MRL, NJP y RS escribieron el documento con aportes de todos los autores.

Correspondencia a Ramunas Stepanauskas.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature agradece a Damien Eveillard y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Durante un transcurso de tiempo que abarcó desde la inoculación hasta la fase estacionaria, se midió la concentración de oxígeno en botellas selladas que contenían aislados cultivados de microorganismos acuáticos. Las submuestras de estas incubaciones se probaron con RSG, después de lo cual se midió la fluorescencia y la abundancia celular mediante citometría de flujo. Se desarrolló una curva de calibración comparando la intensidad de fluorescencia celular promedio con el consumo de oxígeno que se normalizó para la abundancia de células en cada cultivo.

A. Diversidad de fluorescencia RSG entre células en incubaciones de aislados cultivados. B. Configuración de puertas de células positivas para RSG en diagramas de dispersión de dispersión del lado claro (eje x) y fluorescencia verde (eje y) de células individuales. Cada cultivo fue cerrado individualmente, en base a una muestra de control sacrificada de ese cultivo.

AB. Control de citometría de flujo de procarioplancton marcado con RSG. La muestra de agua de mar del GoM se recolectó el 2 de abril de 2019 y se marcó con RSG antes (A) o después (B) de un tratamiento térmico. Se muestran los primeros 100 000 eventos en ambas muestras (la mayoría de los eventos están en la línea de base). C. Compleción del ensamblaje del genoma de todos los SAG del Golfo de Maine que se probaron con RSG (azul, n = 2572) o SYTO-9 (naranja, n = 1632). Los recuadros indican medias, primer y tercer cuartiles y bigotes que se extienden hasta 1,5 rangos intercuartílicos. D. Concentración de clorofila cerca de Boothbay Harbor (43,84° N, 69,64° W). Las líneas negras verticales indican los días en que se recolectaron muestras para análisis SAG. E. Relación entre las tasas de respiración y la presencia de ADN viral en células individuales. Cada punto de datos representa un género en una sola muestra de campo. F. Optimización de la duración de incubación de RSG para procarioplancton marino. Se indican la abundancia y la intensidad de la fluorescencia de las células positivas para RSG en dos muestras repetidas.

A. SAG del 2 de abril de 2019. B. SAG del 9 de julio de 2019. En ambos árboles, los aislados cultivados se incluyen como referencias filogenéticas y se indican con el color de fuente rojo. Los árboles estaban enraizados en la rama Archaeal, cuando estaba presente, y en el punto medio cuando no se incluían arqueas.

Las células están coloreadas por clase taxonómica, que se determinó mediante la secuenciación del genoma de una sola célula.

Los puntos grandes representan las células que se clasificaron para la genómica de una sola célula. Resaltados en color están los linajes con diferencias pronunciadas en las tasas de respiración entre las fechas de muestreo. Debido a cambios en la configuración del citómetro de flujo, no pudimos estimar las tasas de respiración en las tres muestras de 2017.

A. Células de una muestra recolectada en el océano Atlántico sur (32,35S, 44,02W) el 9 de marzo de 2019. B. Células de una muestra recolectada en el océano Atlántico norte (43,00N, 11,33W) el 22 de agosto de 2018. Los árboles estaban enraizados en el punto medio. Los valores de Bootstrap >0,75 se indican mediante círculos negros.

A. Células de una muestra recolectada en el noreste del Océano Pacífico (47.76N, 127.76E) el 23 de mayo de 2019). B. Células de una muestra recolectada en el Atlántico ecuatorial (3.10N, 29.01W) el 20 de marzo de 2019. Los árboles tienen raíces en la rama arqueal cuando está presente y en el punto medio cuando falta la rama arqueal. Los valores de Bootstrap >0,75 se indican mediante círculos negros.

A. Dispersión frontal de luz y fluorescencia RSG de células recolectadas durante el día. B. Dispersión frontal de luz y fluorescencia RSG de células recolectadas durante la noche. La etiqueta "R1" indica la posición de las células con tasas de respiración intermedias que tenían mayor abundancia durante la noche en comparación con el día. La etiqueta "R2" indica las posiciones de las células con altas tasas de respiración. C. Tasas de respiración específicas del género durante el día (amarillo, n = 190) y la noche (azul, n = 190). Se muestran los géneros a partir de los cuales se secuenciaron al menos tres células positivas para RSG. La fuente roja indica géneros con una diferencia estadísticamente significativa en las tasas de respiración entre el día y la noche (prueba U de Mann-Whitney bilateral, mínimo 4 celdas por punto de tiempo, AAA076-P13 valor de p = 0,010, UBA10364 valor de p = 0,038) . Los recuadros indican la mediana, el primer y tercer cuartil y los bigotes que se extienden hasta 1,5 veces el rango intercuartílico (RIC). Los valores por encima o por debajo de 1,5 IQR se representan como círculos.

A. Células de una muestra recolectada a las 14:00 el 24 de agosto de 2021. B. Células de una muestra recolectada a las 02:00 el 25 de agosto de 2021. Los valores de arranque > 0,75 se indican mediante círculos negros. Los árboles tienen sus raíces en la rama archaeal cuando está presente y en el punto medio cuando falta la rama archaeal.

Aislados microbianos y condiciones de cultivo utilizados en la calibración de fluorescencia RSG (Tabla complementaria 1); metadatos de muestra de campo (Tabla complementaria 2); características de los SAG individuales (Tabla complementaria 3); características de los géneros SAG (Tabla complementaria 4); e Intensidad de fluorescencia normalizada para los kits de perlas NFPPS-52-4K y RCP-30-5A (Spherotech, Lake Forest, IL) (Tabla complementaria 5).

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Recibido: 14 febrero 2022

Aceptado: 01 noviembre 2022

Publicado: 07 diciembre 2022

Fecha de emisión: 22 de diciembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-022-05505-3

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