La nitazoxanida inhibe el KLF5 acetilado

BMC Medicine volumen 21, Número de artículo: 68 (2023) Citar este artículo

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El cáncer de próstata resistente a la castración a menudo hace metástasis en los huesos, y dichas metástasis óseas eventualmente se vuelven resistentes a las terapias disponibles, lo que lleva a la muerte de los pacientes. Enriquecido en el hueso, el TGF-β juega un papel fundamental en el desarrollo de metástasis óseas. Sin embargo, dirigirse directamente a TGF-β o sus receptores ha sido un desafío para el tratamiento de la metástasis ósea. Anteriormente encontramos que TGF-β induce y luego depende de la acetilación del factor de transcripción KLF5 en K369 para regular múltiples procesos biológicos, incluida la inducción de EMT, la invasividad celular y la metástasis ósea. El KLF5 acetilado (Ac-KLF5) y sus efectores posteriores son, por lo tanto, objetivos terapéuticos potenciales para tratar la metástasis ósea inducida por TGF-β en el cáncer de próstata.

Se aplicó un ensayo de invasión de esferoides a células de cáncer de próstata que expresan KLF5K369Q, que imita a Ac-KLF5, para seleccionar fármacos aprobados por la FDA en 1987 para la supresión de la invasión. Se inyectaron células que expresaban luciferasa y KLF5K369Q en ratones desnudos a través de la arteria de la cola para modelar la metástasis ósea. Se aplicaron imágenes de bioluminiscencia, micro-CT) y análisis histológicos para monitorear y evaluar las metástasis óseas. Se utilizaron análisis bioquímicos, bioinformáticos y de secuenciación de ARN para comprender los genes regulados por nitazoxanida (NTZ), las vías de señalización y los mecanismos subyacentes. La unión de NTZ a las proteínas KLF5 se evaluó mediante titulación de fluorescencia, cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y análisis de dicroísmo circular (CD).

NTZ, un agente antihelmíntico, se identificó como un potente inhibidor de la invasión en los ensayos de selección y validación. En la metástasis ósea inducida por KLF5K369Q, NTZ ejerció un potente efecto inhibidor en los modos preventivo y terapéutico. NTZ también inhibió la diferenciación de osteoclastos, un proceso celular responsable de la metástasis ósea inducida por KLF5K369Q. NTZ atenuó la función de KLF5K369Q en la regulación positiva de 127 genes y la regulación negativa de 114 genes. Los cambios en la expresión de algunos genes se asociaron significativamente con una peor supervivencia general en pacientes con cáncer de próstata. Uno de esos cambios fue la regulación positiva de MYBL2, que promueve funcionalmente la metástasis ósea en el cáncer de próstata. Análisis adicionales demostraron que NTZ se unía a la proteína KLF5, KLF5K369Q se unía al promotor de MYBL2 para activar su transcripción y NTZ atenuaba la unión de KLF5K369Q al promotor de MYBL2.

NTZ es un agente terapéutico potencial para la metástasis ósea inducida por el eje de señalización TGF-β/Ac-KLF5 en el cáncer de próstata y probablemente en otros tipos de cáncer.

Informes de revisión por pares

El cáncer de próstata (CaP) es una de las principales causas de mortalidad relacionada con el cáncer en los hombres [1]. En la etapa inicial del CaP, los tumores localizados pueden tratarse con éxito mediante cirugía o radioterapia, pero alrededor del 20-30% de los pacientes recaerán [2]. Aunque los pacientes en recaída suelen ser inicialmente sensibles a la terapia de privación de andrógenos, eventualmente desarrollarán cáncer de próstata resistente a la castración (CPRC) [3]. La mayoría de los CRPC hacen metástasis, y alrededor del 90 % de ellos hacen metástasis en los huesos [4, 5]. Al igual que las metástasis óseas de otras neoplasias malignas, las metástasis de CRPC en el hueso responden inicialmente a terapias dirigidas, como los taxanos. Aún así, prácticamente todos desarrollan resistencia a la terapia y se vuelven incurables. Para las metástasis óseas resistentes a los medicamentos, los tratamientos disponibles como denosumab, ácido zoledrónico y bisfosfonatos solo pueden aliviar los síntomas o la morbilidad y prevenir o retrasar los eventos relacionados con el esqueleto (SRE). Estos tratamientos no mejoran significativamente la supervivencia global de los pacientes [6, 7]. Por lo tanto, se necesita urgentemente desarrollar terapias novedosas y efectivas contra la metástasis ósea resistente a los medicamentos para el cáncer de próstata y otros tipos de neoplasias malignas que desarrollan metástasis óseas, incluido el cáncer de mama, el cáncer de pulmón y el mieloma múltiple.

El entorno óseo es rico en TGF-β (factor de crecimiento transformante-β), una citocina que regula diversos procesos fisiológicos y patológicos. El TGF-β desempeña un papel fundamental en el desarrollo de metástasis óseas, aunque suprime la proliferación celular y el crecimiento tumoral en las primeras etapas de la tumorigénesis [8,9,10,11]. Aunque la señalización de TGF-β es un objetivo atractivo para el tratamiento de la metástasis ósea, la orientación directa de TGF-β y sus receptores ha demostrado ser un desafío por diferentes razones [12,13,14]. Por ejemplo, el TGF-β tiene funciones críticas en la homeostasis de los tejidos [14], y los compuestos dirigidos al TGF-β a menudo no son selectivos y, por lo tanto, podrían causar toxicidad en los tejidos cardíacos y la piel [15, 16].

Nuestros estudios previos demostraron que, en las células epiteliales, el TGF-β induce la acetilación del factor de transcripción KLF5 (Krüppel-like factor 5) en la lisina 369 (K369) [17, 18]. Posteriormente, TGF-β y KLF5 acetilado (Ac-KLF5) forman un eje de señalización para regular la transcripción de genes y varios procesos celulares como la proliferación celular, la motilidad e invasión celular y la transición epitelial-mesenquimatosa (EMT) [17,18,19, 20,21]. Más recientemente, descubrimos que el eje TGF-β/Ac-KLF5 también induce metástasis óseas y resistencia a los medicamentos en el cáncer de próstata [22, 23]. Es importante destacar que las metástasis de cáncer de próstata del entorno óseo rico en TGF-β expresan niveles más altos de Ac-KLF5 que las de los tejidos viscerales [23]. El hecho de que TGF-β y Ac-KLF5 formen un eje y que Ac-KLF5 sea esencial para que TGF-β induzca la metástasis ósea sugiere que Ac-KLF5 y sus efectores aguas abajo son objetivos terapéuticos alternativos para el tratamiento de TGF-β inducido. metástasis óseas en CaP.

En este estudio, adoptamos un ensayo de detección de invasión de esferoides in vitro para células de cáncer de próstata que expresan KLF5K369Q, un mutante que imita a Ac-KLF5 [22, 23]. Utilizando el sistema, examinamos 1987 fármacos aprobados por la FDA para identificar fármacos que inhiben la invasión celular y la metástasis ósea. Aquí, describimos los resultados de la detección y presentamos datos de un fármaco antihelmíntico, la nitazoxanida (NTZ), como un potente inhibidor de la metástasis ósea en un modelo de ratón. También presentamos datos celulares y moleculares que respaldan el efecto inhibitorio de NTZ sobre la metástasis ósea y brindan mecanismos sobre cómo actúa NTZ para suprimir la metástasis ósea.

La mini biblioteca de fármacos aprobada por la FDA (n.º de catálogo: HY-L022M), que contenía 1987 fármacos en placas de 96 pocillos y se disolvió en 10 μl de dimetilsulfóxido (DMSO) a 10 mM, se adquirió de MedChemExpress (Shanghai, China). Se adquirió nitazoxanida adicional (Cat #: HY-B0217) de MedChemExpress y se disolvió en DMSO a una concentración de 100 mM.

Hemos establecido previamente líneas celulares de PCa humano PC-3 y DU 145 estables que expresan el KLF5 de tipo salvaje, el mutante que imita a Ac-KLF5 KLF5K369Q (KQ), el mutante deficiente en acetilación KLF5K369R (KR) y el control del vector pLHCX. [22]. Células PC-3 que expresan diferentes formas de KLF5, incluidas PC-3-KLF5, PC-3-KQ, PC-3-KR y PC-3-pLHCX, se mantuvieron en medio RPMI-1640 suplementado con suero bovino fetal al 10 %. (FBS, Biological Industries, HAMEK, Israel) y penicilina/estreptomicina al 1% (100 U/mL, Biological Industries). Se cultivaron células DU 145 que expresaban diferentes formas de KLF5 en medio mínimo de Eagle (MEM) (Corning, Nueva York, EE. UU.) con FBS al 10 %.

Las células PC-3-KLF5, PC-3-KQ y PC-3-KR se infectaron con lentivirus que expresan la luciferasa (HBLV-LUC-PURO, Hanbio, Shanghai, China). Las células infectadas se seleccionaron para poblaciones de células estables en un medio que contenía puromicina (2 μg/mL).

La línea celular de macrófagos RAW264.7 se obtuvo de American Type Cell Culture (ATCC, Manassas, VA, EE. UU.) y se cultivó en medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) (Biological Industries) complementado con 10% de FBS. Todas las células se cultivaron a 37°C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2.

Las células PC-3 que expresan diferentes formas de KLF5 se suspendieron en un medio sin suero y se sembraron en la cámara superior de un dispositivo trans-well (Cat #: 353097, Corning) a 5 × 104 células por pozo. Se añadieron setecientos cincuenta μL de medio completo que contenía FBS al 15 % a la cámara inferior. Cuarenta y ocho horas más tarde, las células de la parte superior de la membrana se rasparon con un bastoncillo de algodón, mientras que las células de la parte inferior se tiñeron con cristal púrpura (Cat #: C0121, Beyotime Biotechnology, Shanghái, China) y se fotografiaron con un estereoscopio. (Mshot, Cantón, China). Luego, la membrana se colocó en 500 μl de ácido acético al 33 % en la cámara inferior para disolver las células. Las densidades ópticas de las células disueltas se midieron utilizando un lector de microplacas (BioTek, Winooski, Vermont, EE. UU.) a 570 nm.

El ensayo de invasión se realizó como se describió anteriormente [24]. Brevemente, las células PC-3-KQ con una confluencia del 80-90 % se sembraron en placas de fondo redondo de 384 pocillos con unión ultrabaja (Cat #: 4516, Corning) a 500 células por pocillo en 80 μL de medio. A continuación, las placas se centrifugaron a 320 g durante 4 min para agrupar las células en el fondo de los pocillos y se incubaron durante 3 días. El cuarto día, se extrajeron 40 μL de medio de cada pocillo, se añadieron 40 μL de la mezcla de medio-matrigel a cada pocillo y las células se cultivaron durante otros 3 días. El matrigel (Cat #: 354234, Corning) era de Corning y el medio contenía FBS al 1%. Al final de la incubación, se tomaron imágenes con un microscopio de contraste de fase (Eclipse Ti2, Nikon, Tokio, Japón) con lentes de objeto de 10x, y se midió el área total de las células y el área de la esfera central de las células (Fig. 1a). medido usando el software Image J. El área de invasión se calculó utilizando la siguiente fórmula: área de invasión = área total de células – área de esfera central [25].

Detección de fármacos aprobados por la FDA para aquellos que inhiben la invasión celular inducida por KLF5 acetilado. un esquema del flujo de trabajo de detección. b Efectos inhibitorios de los medicamentos aprobados por la FDA en 1987, junto con el control del vehículo (puntos verdes señalados por flechas verdes), sobre la invasión de células PC-3-KQ, según se analizó mediante el ensayo de invasión de esferoides 3D. Cada punto representa un fármaco o control y los puntos están alineados a lo largo del eje X. El eje Y indica el área de invasión promedio entre dos pocillos para cada fármaco. La línea horizontal azul indica el área de invasión media de todos los fármacos y controles, mientras que la línea horizontal roja indica el 50 % del área de invasión media. c Proporciones de los medicamentos de 1987 que están aprobados como medicamentos no oncológicos (color púrpura), medicamentos terapéuticos dirigidos oncológicos (color naranja) y medicamentos quimioterapéuticos oncológicos (color rojo). d Identificación de los 25 fármacos más eficaces mediante el ensayo de invasión de esferoides 3D con múltiples concentraciones (μM). El mapa de calor muestra las tasas de invasión (%) de las múltiples concentraciones de cada fármaco en comparación con el control del vehículo, como lo indican las cuadrículas azules con distintas intensidades. Los nombres de los 25 medicamentos se muestran en la parte inferior, con 6 de los más efectivos marcados con recuadros rojos. e La estructura química de la nitazoxanida

Para el cribado de fármacos, se añadieron fármacos a la mezcla de medio de matrigel cuando se reemplazó el medio de cultivo el día 4. Para la ronda inicial de cribado, se utilizó una concentración final de 10 μM para todos los fármacos. Se utilizaron múltiples concentraciones de fármacos para la segunda ronda de selección, incluidos 0, 0,001, 0,01, 0,1, 1 y 10 μM. Se repitieron pocillos duplicados para cada concentración.

De acuerdo con las instrucciones del fabricante, la viabilidad celular se midió utilizando un kit de Beyotime Biotechnology. Brevemente, las células se sembraron en placas de 96 pocillos a 5 × 103 células por pocillo, se incubaron durante la noche y luego se trataron durante 48 h con fármacos a 0, 0,02, 0,05, 0,14, 0,41, 1,23, 3,7, 11,1, 33,3 y 100 µM. Se analizaron cuatro fármacos: furagina, nifuratel, nitazoxanida y retapamulina. Al final del tratamiento con el fármaco, se retiró el medio, se añadió la solución de CCK-8 a cada pocillo a razón de 100 μL/pocillo y se incubó durante 1,5 h a 37 °C, y se midió la densidad óptica (DO) a 450 nm usando un lector de microplacas (BioTek).

También probamos una gama más amplia de concentraciones de NTZ en células PC-3-KQ y DU 145-KQ utilizando el ensayo CCK-8 al sembrar 2 × 103 células y 2,5 × 103 células en cada pocillo de placas de 96 pocillos. Las células PC-3-KQ se trataron con NTZ a 0, 0,01, 0,1, 1,25, 2,5 y 5 μM, mientras que las células DU 145-KQ se trataron con NTZ a 0, 0,01, 0,1, 5, 10 y 20 μM durante 0, 24, 48 y 72 h. El número de células viables se determinó usando la solución CCK-8 como se describe anteriormente.

Se sembraron células PC-3-KQ y DU 145-KQ en placas de 6 pocillos a razón de 1 × 103 células/pocillo. Después de la incubación durante 24 h, las células PC-3-KQ se trataron con NTZ a 0, 1,25, 2,5 y 5 μM, mientras que las células DU 145-KQ se trataron con NTZ a 0, 5, 10 y 20 μM durante 8 días. . El medio que contenía el fármaco se reemplazó cada 2 días. El octavo día, las células se enjuagaron con PBS frío, se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 10 minutos, se tiñeron con cristal púrpura durante 10 minutos y se fotografiaron, y las imágenes se analizaron con el software Image J.

Se compraron ratones desnudos Balb / c machos de 3 a 4 semanas de edad en Charles River (Beijing, China). A su llegada al Centro de Animales de la Universidad de Ciencia y Tecnología del Sur (SUSTech), los ratones fueron puestos en cuarentena durante una semana antes de su uso. Todos los ratones se mantuvieron y manipularon siguiendo la guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

Para medir si NTZ inhibe la metástasis ósea inducida por Ac-KLF5, utilizamos modos de prevención y terapia. Para el modelo de prevención, siguiendo un método publicado recientemente [26], los ratones fueron anestesiados, la arteria de la cola se limpió con alcohol para expandir el vaso sanguíneo y 1 × 106 células cancerosas (PC-3-KQ-Luc o PC-3 -Células KR-Luc) en 100 μL de PBS se inyectaron en la arteria de la cola en poco tiempo (< 3 s) [26]. Luego, los ratones se dividieron al azar en grupos de vehículo y NTZ (seis ratones en cada grupo) y recibieron tratamiento el día 0. Cada semana se determinó el crecimiento del tumor y el peso corporal. Después de 5 semanas de tratamiento, se sacrificaron todos los ratones y se extirparon los tejidos óseos y los órganos principales para la tinción con hematoxilina y eosina (H&E). La selección de 5 semanas para la investigación se basa en el experimento piloto, en el que se formaron metástasis óseas claras 5 semanas después de la inyección, pero no se detectaron tumores en otros órganos, incluidos el cerebro, el hígado, los pulmones, el bazo, el corazón, la próstata y la vesícula seminal. , intestino delgado y testículos (datos no mostrados).

Para el modelo de terapia, se inyectaron 1 × 106 células PC-3-KQ-Luc en 100 μL de PBS en la arteria caudal de cada ratón como se describe anteriormente. Cada 7 días, los ratones se sometieron a imágenes de bioluminiscencia (BL) y se dividieron aleatoriamente en los grupos de vehículo y NTZ (n = 6 de cada grupo) y recibieron tratamiento el día 7. El crecimiento del tumor y el peso corporal se midieron cada semana. A los 35 días después del tratamiento final, los tejidos óseos de cada grupo se extrajeron para tomografía microcomputadora (micro-CT) de alta resolución, tinción H&E y tinción inmunohistoquímica.

El crecimiento tumoral en el hueso se determinó una vez a la semana mediante imágenes BL in vivo usando Living Image Software 4.4 (IVIS Spectrum, PerkinElmer Health Sciences, Massachusetts, EE. UU.). Diez minutos después de la inyección intraperitoneal de sal sódica de D-luciferina (15 mg/mL, 10 μL/g BW) (GM-040611, Genomeditech, Shanghái, China), se adquirieron imágenes de bioluminiscencia con las siguientes condiciones: filtro de emisión abierto, tiempo de exposición = 60 s, binning = medio: 8, campo de visión = 12,9 × 12,9 cm y f/stop = 1. Luego, las imágenes se analizaron utilizando el software Living Image 4.4 (PerkinElmer). Al final del tratamiento, las intensidades de bioluminiscencia se midieron mediante el flujo de fotones de la región de interés (ROI) y se compararon entre los grupos de tratamiento con vehículo y NTZ.

Para el tratamiento farmacológico, se usó carboximetilcelulosa sódica (CMC) al 1 % (n.º de catálogo: CC0113, Leagene Biotechnology, Beijing, China) como control del vehículo, y la NTZ se resolvió en CMC. La NTZ se administró a ratones mediante administración intragástrica (100 mg/kg de peso corporal) todos los días.

Después del sacrificio de los ratones, se retiraron las patas traseras y se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 48 h. Luego se escanearon las extremidades usando un escáner micro-CT (Skyscan1276, Bruker, Kontich, Bélgica). Para las imágenes de micro-CT, los parámetros de exploración fueron: fuente de voltaje, 60 kV; corriente de fuente, 100 μA; filtro AI de 0,5 mm; tamaño de píxel, 10 μm; paso de rotación, 0,4 grados. Luego, las imágenes se procesaron y construyeron con el software NRecon (Versión 1.7.1.6, Bruker) y se convirtieron con Dataviewer (Versión 1.5.4, Bruker). La región de interés (ROI), establecida a 0,5 mm de la placa de crecimiento del fémur, se analizó utilizando el programa CT-Analyser (CTAn). Los parámetros incluyeron volumen óseo/volumen total (BV/TV), número trabecular (Tb.N), separación trabecular (Tb.Sp) y grosor trabecular (Tb.Th). Finalmente, las imágenes 3D se realizaron en el software CTvox (Versión 2.0, Bruker).

Los fémures se descalcificaron en una solución de descalcificación de etilendiaminotetraacético (EDTA) (Cat #: R20403-5L, OKA, Beijing, China) durante 14 a 21 días. Después de la descalcificación, los tejidos óseos se deshidrataron en un gradiente de etanol del 70 al 95 %, se sumergieron en n-butanol durante 6 h y luego se incluyeron en parafina. Los bloques de tejido se cortaron en secciones de 4 μm. Después de hornear en un horno a 63 °C durante 1,5 h, los portaobjetos de tejido se desparafinizaron con xileno, se hidrataron con etanol en gradiente y luego se tiñeron con H&E (Cat #: BA4025, BaSO, Zhuhai, China). Luego se montaron los portaobjetos para el análisis con resinas neutras (Cat #: 25608-33-7, Sigma-Aldrich, MO, EE. UU.).

La tinción inmunohistoquímica se realizó siguiendo los procedimientos establecidos. Brevemente, se desparafinaron secciones de 4 μm de tejido óseo en xileno y se rehidrataron en etanol en gradiente. El antígeno endógeno se recuperó incubando portaobjetos en tampón de citrato de sodio 10 mM (Cat #: C1010, Solarbio, Beijing, China) durante la noche en un horno a 65 °C. Después de la recuperación del antígeno, las secciones de tejido se incubaron con peróxido de hidrógeno al 3 % a temperatura ambiente durante 10 min para bloquear la actividad de la catalasa endógena. Luego se incubaron en una solución de bloqueo (albúmina V bovina al 0,1 % mezclada con suero de cabra al 10 %) durante 40 min y una solución que contenía un anticuerpo primario (MMP9, 1:1000, Cat #: ab76003, Abcam, Cambridge, Reino Unido; MYBL2, 1:100, Cat #: ab76009, Abcam) durante 1,5 h. Después de enjuagar con PBS 3 veces, los portaobjetos se incubaron con la solución de anticuerpo secundario durante 15 min y luego con la solución DAB utilizando el kit MaxVision II HRP (Cat #: KIT-5920, MXB Biotechnologies, Fuzhou, China). Los núcleos se contrastaron con hematoxilina durante 2 min. A continuación, los portaobjetos se deshidrataron con gradiente de etanol (75-100 %) y xileno y se montaron con cubreobjetos utilizando el medio de montaje de endurecimiento rápido. Todas las diapositivas se escanearon con un sistema de escáner Aperio VERSA 8 (Leica, Wetzlar, Alemania) y se analizaron con el software Image J (Image J 1.48v, NIH, Bethesda, MD, EE. UU.).

Se utilizaron tres sistemas de cultivo diferentes para el ensayo de diferenciación de osteoclastos in vitro. En el primero, se sembraron células RAW264.7 en placas de 96 pocillos a razón de 1 × 103 células/pocillo y se cultivaron durante la noche. A continuación, las células se estimularon con RANKL de ratón recombinante (Cat #: CR06, Novoprotein, Shanghái, China) a 50 ng/ml en presencia o ausencia de diversas concentraciones de NTZ (0, 6,25, 12,5, 25 μM). El medio se reemplazó cada 2 días hasta que se observaron osteoclastos en el grupo control. A continuación, las células se fijaron en paraformaldehído al 4 % durante 10 min, se enjuagaron con agua desionizada precalentada y se tiñeron con fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP) utilizando un kit de Sigma-Aldrich (Cat #: A387) para visualizar osteoclastos (≥ 3 núcleos/ celúla). El efecto de NTZ en la diferenciación de osteoclastos se determinó contando el número de células multinucleadas utilizando el software Image J (Image J 1.48v).

En el segundo ensayo in vitro, utilizamos medio acondicionado (CM) de células que expresan Ac-KLF5 tratadas con NTZ. Las células PC-3-KQ se sembraron en placas de 6 pocillos a razón de 1 × 105 células por pocillo y se cultivaron durante la noche. Las células se trataron con NTZ a 0, 1,25, 2,5 y 5 μM durante 36 h en medio completo (RPMI1640 con FBS al 10 % y penicilina-estreptomicina al 1 %). Se eliminó el medio y las células se lavaron dos veces con medio RPMI1640 que contenía FBS al 0,5 % y se cultivaron en el mismo medio durante otras 12 h. Posteriormente, el medio acondicionado (CM) se recogió de cada grupo, se centrifugó, filtró, dividió en alícuotas y almacenó a -80 °C para su uso posterior o se usó inmediatamente en los experimentos de cocultivo. El CM de cada grupo se mezcló con el medio DMEM (10 % FBS) en una proporción de 1:3 y se agregó RANKL a una concentración más baja (10 ng/mL). Se incubaron células RAW264.7 en placas de 96 pocillos con cultivo de 24 h con el medio que contenía CM durante 7 días, y el medio se reemplazó cada 2 días. Se realizó el ensayo de tinción TRAP para determinar el número de osteoclastos diferenciados según las instrucciones del fabricante.

El tercer ensayo in vitro involucró el cocultivo directo entre células RAW264.7 y células cancerosas. Las células RAW264.7 se sembraron en placas de 96 pocillos a razón de 700 células por pocillo y se dejaron adherir durante 12 h. Se añadieron células PC-3-KQ a cada pocillo a razón de 300 células/pocillo y el cultivo continuó durante 12 h. Se añadió NTZ para tratar las células durante 48 h en varias concentraciones finales (0, 1,25, 2,5, 5 μM). El medio RAW264.7 se mezcló con el medio PC-3 a razón de 7:3 y la mezcla se utilizó para reemplazar el medio de cultivo cada 2 días. Después de 7 días, se determinó la diferenciación de osteoclastos como se describe anteriormente.

El procedimiento para la tinción de TRAP en tejidos se describió en nuestro estudio anterior [23]. Brevemente, las secciones de hueso desparafinado e hidratado se incubaron en ácido acético 0,2 M durante 20 minutos y luego en ácido acético 0,2 M que contenía la sal roja TR (1,1 mg/mL) y fosfato de naftol AS-MX (0,5 mg/mL) durante aproximadamente 45 minutos a 37°C. Cuando las células TRAP-positivas se vuelven rojas, según se controló mediante microscopía, los portaobjetos se contrastaron con hematoxilina y se montaron con cubreobjetos con glicerina. A continuación, los portaobjetos se escanearon y analizaron como se describe anteriormente.

Las células PC-3-KQ y PC-3-KR se sembraron en placas de 6 pocillos a razón de 1 × 105 células/pocillo y se cultivaron durante 24 h. Luego se reemplazó el medio de cultivo por el que contenía 0 o 5 μM de NTZ y el tratamiento fue de 48 h. A continuación, las células se enjuagaron una vez con PBS preenfriado y se recogieron en el reactivo TRIzol (Cat #: 15596018, Invitrogen, Carlsbad, California, EE. UU.). El Instituto de Genómica de Beijing (Wuhan, China) realizó la extracción de ARN, la construcción de bibliotecas utilizando el protocolo SE100 y la secuenciación con una plataforma DNBSEQ con una longitud de secuenciación de 100 pb en los extremos de los pares. El procesamiento de datos sin procesar se completó como se describió anteriormente [14]. Todos los datos de RNA-seq fueron procesados ​​por FASTQC para la evaluación de la calidad y alineados con el genoma humano utilizando Bowtie2 (V2.2.5) [27].

El algoritmo edgeR se realizó para identificar genes expresados ​​diferencialmente entre células que expresan KLF5K369Q y KLF5K369R y el tratamiento y control de NTZ en células que expresan KLF5K369Q, con un |cambio de pliegue| ≥ 1,5 y una tasa de descubrimiento falso < 0,05. Nuestros datos de secuenciación se han depositado en la base de datos Gene Expression Omnibus con el número de acceso GSE216126.

Para los genes cuya expresión fue modulada específicamente por KLF5K369Q y dicha modulación fue atenuada por NTZ, se realizó el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier para evaluar si los cambios de expresión de un gen en el cáncer de próstata humano están relacionados con la supervivencia del paciente. Analizamos los datos del East Coast Dream Team (ECDT) de Stand Up To Cancer/Prostate Cancer Foundation (SU2C/PCF) (https://www.cbioportal.org/) utilizando el paquete Survival R. Los pacientes se estratificaron en dos grupos según el nivel medio de expresión de un gen en cada conjunto de datos. Se utilizó la prueba de rango logarítmico para calcular los valores de p. También se calcularon los cocientes de riesgos instantáneos univariados.

Los genes significativamente asociados con la supervivencia se compararon en cuanto a los niveles de expresión entre tejidos de próstata normales, cánceres de próstata y metástasis óseas utilizando el conjunto de datos SU2C/PCF [28] y el conjunto de datos GSE21034 [29]. Se usó la prueba de suma de rangos de Wilcoxon para determinar los valores de p para las comparaciones entre dos grupos, mientras que la prueba de Kruskal-Wallis se usó para las comparaciones multigrupo. Se realizaron pruebas estadísticas bilaterales y se consideró estadísticamente significativo un valor de p < 0,05. Todos los análisis se realizaron en R4.1.3 (https://www.R-project.org/).

El ARN total se extrajo de las células con el kit de extracción de ARN total Eastep Super (Cat #: LS1040, Promega, Shanghái, China) y se cuantificó con NanoDrop One (Thermo Fisher Scientific, Madison, EE. UU.). El ADNc monocatenario se sintetizó a partir de 1 μg de ARN total utilizando el kit HiScript III All-in-one RT SuperMix (Cat #: R333-01, Vazyme, Nanjing, China). Para qRT-PCR, la plantilla de ADNc se mezcló con el reactivo SYBR Green en agua libre de enzimas, y para la PCR se utilizó el sistema táctil Qtower3 (Analytik Jena, Jena, Alemania) con el siguiente programa: desnaturalización inicial a 95 °C para 5 min, 40 ciclos de 95°C por 30 s, 60°C por 30 s, y 72°C por 30 s, y una fusión final por 15 s. Se utilizó GAPDH como control interno. Las secuencias de los cebadores fueron las siguientes: 5′-CTTGAGGCGAGTCCAAAGACTG-3′ (MYBL2 adelante), 5′-AGTTGGTCAGAAGACTTCCCT-3′ (MYBL2 atrás), 5′-CAGCATTTCATCGAGGTAGAGAC-3′ (TIMM8A adelante), 5′-AGCCCGACTGTCCAACTTTG-3′ ( TIMM8A inversa), 5′-TGAAGGTGACAGAGCCTCTGGAT-3′ (E-cadherina directa), 5′-TGGGTGAATTCGGGCTTGTT-3′ (E-cadherina inversa), 5′-TGAAGGTGACAGAGCCTCTGGAT-3′ (Vimentina directa), 5′-CTTGTAGGAGTGTCGGTTGTTAAG-3 ′ (Vimentina inversa), 5′-GACAATGCCCCTCAAGTGTT-3′ (N-cadherina adelante), 5′-CCATTAAGCCGAGTGATGGT-3′ (N-cadherina inversa), 5′-CTTCCAGCAGCCCTACGAC-3′ (Caracol adelante), 5′-CGGTGGGGTTGAGGATCT -3′ (Caracol inverso), 5′-TGTTTGCAAGATTCTGCGGC-3′ (Slug adelante), 5′-TGCAGTCAGGGCAAGAAAAA-3′ (Slug inverso), 5′-CCATAAAGGGCAACCAAGAG-3′ (Fibronectina adelante), 5′-ACCTCGGTGTTGTAAGGTGG-3 ' (Fibronectina inversa), 5′-TGCAGTCAGGGCAAGAAAAA-3′ (Slug inversa), 5′-TGTACCGCTATGGTTACACTCG -3′ (MMP9 directa), 5′-GGCAGGGACAGTTGCTTCT-3′ (MMP9 inversa), 5′-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3′ ( GAPDH hacia delante) y 5′-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3′ (GAPDH hacia atrás).

Las células en placas de 6 pocillos se lavaron con PBS frío y se recogieron en un tampón de lisis que contenía inhibidores de fosfatasa y proteasa (Cat #: P1045, Beyotime) para extraer proteínas. Después de centrifugar durante 10 min a 4 °C en una centrífuga refrigerada, se recogió el sobrenadante y se mezcló con el tampón de carga 4X, se hirvió en un baño de calor metálico a 100 °C durante 10 min y luego se sometió a SDS-PAGE al 10 %. . Las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF activada (tamaño de poro de 0,45 μm, número de catálogo: IPVH00010, Millipore, Carrigtwohill, Irlanda). La membrana se bloqueó con leche desnatada al 5 % durante 40 min a temperatura ambiente, se incubó con un anticuerpo primario a 4 °C durante la noche, se lavó con PBS 3 veces (10 min cada una) y se incubó con anticuerpo secundario conjugado con HRP contra IgG de conejo. (1:5000, Cat #:7074S, Tecnología de señalización celular, Danvers, MA, EE. UU.) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las señales se visualizaron utilizando el reactivo de sustrato ECL (Cat #: K-12043-D20, Advansta, California, EE. UU.) en un analizador automático de quimioluminiscencia (ChampChemi 610 plus, Beijing, China). El anticuerpo GAPDH se adquirió de Cell Signaling Technology (1:2000, Cat #: 5174S), el anticuerpo KLF5 fue de Proteintech (1:1000, Cat #: 21017-1-AP, Chicago, EE. UU.), el anticuerpo MYBL2 fue de Abcam (1:2000, Cat #: ab76009, Cambridge, MA, EE. UU.) y el anticuerpo MMP9 era de Abcam (1:2000, Cat #: ab 76003).

Ribobio (Guangzhou, China) sintetizó pequeños ARN de interferencia (siARN) para KLF5 y el control negativo y los usó para transfectar células a 50 nM usando el reactivo Lipofectamine RNAiMax (Cat #: 13778150, Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de 48 h, las células se recolectaron para análisis, incluida la prueba de eficiencia de eliminación mediante transferencia Western. La secuencia del siRNA de KLF5 fue 5′-AAGCUCACCUGAGGACUCA-3′ [30].

El ensayo ChIP se realizó con el kit de IP de cromatina enzimática SimpleChIP (n.º de catálogo: 9003s, tecnología de señalización celular) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células se trataron con formaldehído al 1 % durante 10 min para la reticulación, se extinguieron con glicina durante 5 min a temperatura ambiente, se recogieron y se digirieron con nucleasa microcócica durante 20 min a 37 °C. Después de detener la reacción mediante la adición de EDTA, el ADN se fragmentó mediante sonicación y los extractos se incubaron con anticuerpo KLF5 (n.º de catálogo: 21017-1-AP, Proteintech) o IgG (n.º de catálogo: 2729P, Cell Signaling Technology). Los fragmentos de ADN eluidos se detectaron mediante PCR normal y PCR cuantitativa en tiempo real con los siguientes cebadores: 5′-CCTTCCTCGGTCTTCGCTAT-3′ (MYBL2 n.° 1 directo), 5′-GCACTTTTCTATCTCCCGCCA-3′ (MYBL2 n.° 1 inverso), 5′- CCTGGAGATACTGGTGTGCAT-3′ (MYBL2 n.° 2 adelante) y 5′-GGCCAAAAGAAACGGCCTCT-3′ (MYBL2 n.° 2 inverso).

KLF5 de tipo salvaje y los mutantes KLF5K369Q y KLF5K369R se clonaron en el vector de expresión pET15b (n.° de catálogo: ZK146, Zoman Biotechnology, Beijing, China), en el que se agregó una etiqueta de histidina al extremo N de la proteína KLF5 tras la expresión. Los plásmidos se expresaron en la cepa BL21 DE3 de E. coli (Cat #: EC1003, Weidi Biotechnology, Shanghai, China). Las bacterias se recogieron por centrifugación, se sometieron a ultrasonidos en imidazol 10 mM en PBS (10 mM, pH 7,4) y se incubaron con la resina His60 Ni Superflow (Cat #: L00666, GenScript, Nanjing, China). Los complejos de resina His-KLF5 se lavaron y eluyeron con imidazol 300 mM en PBS (10 mM, pH 7,4). La proteína KLF5 se purificó adicionalmente mediante filtración en gel en una columna Superdex 200 Increment 10/300 (Cat #: 10243519, GE, MA, EE. UU.) utilizando PBS (10 mM, pH 7,4) para usar en ensayos de unión.

Se midió el espectro de fluorescencia de la proteína KLF5 de tipo salvaje o mutante a 1 μM en 2 ml de PBS con un espectrómetro de fluorescencia (HORIBA, Kyoto, Japón) y se obtuvieron los espectros de fluorescencia para longitudes de onda de 300 a 500 nm. En el análisis se utilizaron NTZ con varios rangos de concentración y varios incrementos, incluidos 0,1–1 μM con un incremento de 0,1 μM, 1–5 μM con un incremento de 0,5 μM, 5–10 μM con un incremento de 1 μM y 10 –30 μM con un incremento de 5 μM. La incubación con NTZ fue por 5 s a temperatura ambiente. Los datos se procesaron y ajustaron para obtener las afinidades de unión utilizando el software Origin (OriginLab, Northampton, MA, EE. UU.), y los valores de Kd se determinaron mediante las respuestas a una longitud de onda de 290 nm.

La proteína KLF5 purificada o su mutante a 0,5 mg/ml en 0,5 ml se incubó con resina His60 Ni Superflow durante 30 min a temperatura ambiente. Después de lavar dos veces, los complejos de perlas de proteína se diluyeron a 1 ml en PBS. Se usó resina His60 Ni Superflow sin proteína como control negativo (es decir, blanco). Se añadieron diez microlitros de NTZ 1 mM a los complejos de perlas de proteína y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las reacciones se lavaron con PBS y luego se incubaron con acetonitrilo para desnaturalizar la proteína y liberar la NTZ capturada. A continuación, se detectó NTZ en el sobrenadante mediante análisis HPLC con el instrumento Agilent 1260 Infinity II (California, EE. UU.) y la columna C18 (25 cm × 4,6 mm, 5 μm) con un caudal de 0,5 ml/min durante 20 min en el longitud de onda de 298 nm.

La proteína KLF5 de tipo salvaje o mutante en 2 ml de PBS a 0,01 mg/ml se analizó con un espectropolarímetro CD (Chirascan, Applied Photophysics, Surrey, Reino Unido) a 200–260 nm. Los espectros se registraron en una cubeta de 1 cm de paso óptico. Se realizó un promedio de tres exploraciones repetidas en cada espectro. Se añadió NTZ a la solución de proteína a una concentración final de 1 μM y se incubó durante 2 ha 4 °C antes de la detección de CD.

Los datos cuantitativos se presentaron como media ± DE, y todos los experimentos se repitieron al menos tres. Se usó la prueba t de Student o ANOVA unidireccional para el análisis estadístico. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el software GraphPad Prism 6 [31]. Un valor de p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Confirmamos que, entre las líneas celulares de cáncer de próstata comúnmente utilizadas (LNCaP, C4-2B, PC-3 y DU 145), las células PC-3 expresaron el nivel más alto de KLF5 (Archivo adicional 1: Fig. S1a). Por lo tanto, elegimos las líneas celulares KLF5-null PC-3 previamente establecidas que expresan el KLF5 de tipo salvaje, el mutante KLF5K369Q que imita a Ac-KLF5 y el mutante KLF5K369R deficiente en acetilación [23] para la detección de drogas y el modelado de metástasis. Los niveles de expresión de KLF5 en estas líneas celulares se muestran en la Fig. S1b. También validamos que las células que expresan KLF5K369Q eran más migratorias (archivo adicional 1: Fig. S1c, S1d) e invasivas en el ensayo transwell (archivo adicional 1: Fig. S1e, S1f) que las células que expresan KLF5 y KLF5K369R. Como era de esperar, las células que expresan KLF5K369Q también expresaron niveles más altos de marcadores mesenquimales, incluidos vimentina, N-cadherina, caracol, babosa y fibronectina (archivo adicional 1: Fig. S1g, S1h).

El ensayo de invasión de esferoides en 3D se usó para probar fármacos aprobados por la FDA en 1987 por su capacidad para inhibir la invasión celular (Fig. 1a). A 10 μM, 87 de los medicamentos de 1987 inhibieron la invasión celular en al menos un 50 %, incluidos 9 agentes de quimioterapia, 32 medicamentos contra el cáncer dirigidos y 46 medicamentos no oncológicos (Fig. 1b, c; Archivo adicional 2: Tabla S1).

Para los 87 fármacos, repetimos la detección de invasión utilizando una serie de concentraciones para cada fármaco, incluidas 0, 0,001, 0,01, 0,1, 1 y 10 μM. Los efectos de estos fármacos sobre la invasión celular se enumeran en la Tabla S1. El ensayo de invasión con múltiples concentraciones de fármacos se repitió para los 25 principales de los 87 fármacos que mostraron una inhibición de la invasión dependiente de la dosis, y sus capacidades de inhibición de la invasión se confirmaron nuevamente (Archivo adicional 2: Tabla S2). Estos 25 fármacos se enumeran en la Tabla 1 en el orden de sus capacidades inhibidoras de la invasión.

Para estos 25 medicamentos, buscamos en la base de datos PubMed publicaciones que contenían el nombre de un medicamento y "cáncer", "metástasis" o "metástasis ósea" para evaluar si estos medicamentos han estado implicados en el cáncer y la metástasis. De los 25 fármacos, 11 habían estado bien implicados en el cáncer o la metástasis en la literatura, mientras que 14 tenían publicaciones limitadas o nulas relacionadas con el cáncer (Tabla 1).

De los 25 fármacos, 6 inhibieron la invasión celular en más del 50% a 0,1 μM, incluidos nifuratel, mitomicina C, nitazoxanida, ronidazol, retapamulina y furagina (Fig. 1d, Tabla 1). De los 6 fármacos, la mitomicina C y el ronidazol se excluyeron para estudios adicionales, ya que el primero se ha utilizado ampliamente para tratar el cáncer y la metástasis del cáncer, mientras que el segundo es un agente antiprotozoario utilizado en medicina veterinaria pero no aprobado para uso humano. Para los 4 medicamentos restantes, determinamos la especificidad de eliminación y los valores de IC50 en células de cáncer de próstata PC-3 y DU 145 que expresan KLF5, KLF5K369Q y KLF5K369Q mediante el ensayo CCK-8. Solo la nitazoxanida (NTZ) de los 4 fármacos mostró una IC50 relativamente más pequeña en las células que expresan KLF5K369Q que en las células que expresan KLF5 y KLF5K369R (Tabla 2). NTZ también fue más potente en la inhibición de la invasión al expresar KLF5K369Q que las células que expresan KLF5 (Archivo adicional 1: Fig. S2a, S2b). Por lo tanto, se seleccionó NTZ para análisis adicionales.

Se probó un rango más amplio de concentraciones de NTZ para determinar su efecto en las células PC-3-KQ y DU 145-KQ utilizando el ensayo CCK-8. Como se muestra en las Figs. S3a y S3b, NTZ no afectó el número de células en concentraciones más bajas (0–0.1 μM) pero disminuyó el número de células en concentraciones más altas. En el ensayo de formación de colonias, NTZ redujo el número de colonias con concentraciones más altas (Archivo adicional 1: Fig. S3c-S3f).

Se usaron modos de prevención y terapia para determinar si NTZ inhibe la metástasis ósea inducida por Ac-KLF5. En el modo de prevención (Fig. 2a), las células de cáncer de próstata que expresan el mutante KLF5K369Q que imita a Ac-KLF5 (es decir, PC-3-KQ-Luc) se inyectaron en ratones a través de la arteria caudal en la cola siguiendo un procedimiento descrito recientemente [26 ]. Cinco semanas después de la inyección de células, la metástasis ósea era evidente para las células PC-3-KQ-Luc, ya que la intensidad de la bioluminiscencia era bastante fuerte, según un experimento piloto (datos no mostrados).

La nitazoxanida ejerce un efecto preventivo sobre la metástasis ósea inducida por Ac-KLF5 en células de cáncer de próstata. un diagrama de la línea de tiempo experimental. El día 0, se inyectaron células cancerosas (PC-3-KQ-Luc o PC-3-KR-Luc) en ratones a través de la arteria caudal de la cola, mientras que la nitazoxanida se administró por vía intragástrica. Las intensidades de bioluminiscencia se midieron el día 35. b, c Imágenes de bioluminiscencia (izquierda) de ratones que portaban células PC-3-KQ (b) o células PC-3-KR (c) y recibieron nitazoxanida (NTZ) o el control de disolvente (vehículo ). Las intensidades de bioluminiscencia se indican mediante el flujo de fotones de la región de interés (ROI) (panel derecho, cada punto representa una pata de ratón). n = 12 patas/grupo. d El tratamiento con nitazoxanida redujo significativamente las áreas de tumor óseo formadas por las células PC-3-KQ sin afectar las de las células PC-3-KR. Las secciones de fémur se tiñeron con H&E, y las áreas de células tumorales y las secciones de hueso completo se midieron y compararon entre el tratamiento con NTZ y el grupo de control. Las imágenes representativas se muestran a la izquierda y los resultados estadísticos se muestran a la derecha. n = 6 tumores para cada grupo. B, regiones de hueso trabecular; BM, regiones de la médula ósea; T, regiones tumorales. Barra de escala, 100 μm. Todos los datos se presentan como media ± SD. ** p < 0,01; ***, p < 0,001; ns, no significativamente diferente; según lo estimado por la prueba t de Student

En este modelo, la administración de NTZ al mismo tiempo que la inyección de células tumorales redujo drásticamente la metástasis ósea, como lo indican las señales de bioluminiscencia (Fig. 2b). Mientras tanto, las células PC-3-KR-Luc generaron señales de bioluminiscencia mucho más débiles (Fig. 2c). NTZ no tuvo un efecto significativo en la intensidad de la bioluminiscencia de las células PC-3-KR-Luc (Fig. 2c). La histomorfometría ósea de secciones de tejido óseo reveló que NTZ disminuyó significativamente el área de células tumorales en ratones con células PC-3-KQ-Luc (Fig. 2d). Por el contrario, los ratones con células PC-3-KR-Luc tenían áreas tumorales mucho más pequeñas, que no se vieron significativamente afectadas por NTZ (Fig. 2d).

El peso corporal de los ratones tratados con NTZ no mostró un cambio notable después de 5 semanas en ninguno de los grupos (Archivo adicional 1: Fig. S4a, S4b). Además, ningún ratón en ningún grupo tratado con NTZ tuvo eventos adversos graves, mortalidad o cambios histopatológicos notables en el corazón, los pulmones, el hígado, el bazo y los riñones (Archivo adicional 1: Fig. S4c).

En el modo de terapia, se permitió que las células PC-3-KQ-Luc inyectadas en ratones desarrollaran metástasis ósea durante 7 días antes de administrar NTZ. A los 7 días después de la inyección de células, las señales de bioluminiscencia eran evidentes en la mayoría de los ratones (Archivo adicional 1: Fig. S5). Los ratones se dividieron en dos grupos según las intensidades de la señal de bioluminiscencia de los ratones (Fig. 3a y Archivo adicional 1: Fig. S5). Los ratones se sacrificaron para su análisis después de 4 semanas de tratamiento con NTZ. Similar al hallazgo del modo preventivo, el tratamiento con NTZ disminuyó drásticamente las intensidades de bioluminiscencia (Fig. 3b). El análisis de micro-CT demostró que, mientras que las lesiones óseas eran evidentes en el grupo de control, el tratamiento con NTZ redujo significativamente dichas lesiones (Fig. 3c). El análisis cuantitativo de los parámetros óseos reveló que NTZ aumentó significativamente BV/TV, Tb. N y Tb. Th mientras disminuía potentemente la Tb. Sp (Fig. 3d). La cuantificación de secciones H&E de tejidos óseos confirmó que NTZ redujo significativamente el área tumoral en el hueso (Fig. 3e). Los pesos corporales de los ratones no se vieron afectados por NTZ (Fig. 3f).

El tratamiento con nitazoxanida inhibe la metástasis ósea osteolítica del cáncer de próstata en un modelo de ratón. un diagrama de la línea de tiempo del experimento. Se permitió que las células tumorales colonizaran y crecieran durante 7 días después de la inyección a través de la arteria caudal y antes de que se administrara NTZ mediante inyección intragástrica (seis ratones por grupo). b Imágenes de bioluminiscencia (izquierda) e intensidades (derecha) de ratones después de tratamientos con NTZ o vehículo durante 28 días. n = 12 patas/grupo. c Imágenes micro-CT representativas de fémures y tibias (izquierda) y fotomicrografías micro-CT de fémures (XZ a la derecha). La flecha blanca apunta a la osteólisis formada en la metáfisis del fémur, que desapareció tras el tratamiento con NTZ. d Cuantificaciones de varios parámetros para la microestructura ósea, incluido el volumen óseo por volumen de tejido (BV/TV, n = 6 fémures para cada grupo), número trabecular (Tb.N, n = 6 fémures para cada grupo), separación trabecular (Tb. Sp, n = 6 fémures en el grupo control, n = 5 fémures en el grupo NTZ) y espesor trabecular (Tb.Th, n = 4 fémures en el grupo control, n = 5 fémures en el grupo NTZ). e Tinción H&E de secciones de hueso que muestran áreas de células tumorales (T), hueso (B) y médula ósea (BM) (izquierda). La relación entre el área del tumor y el área del hueso se calculó para cada ratón y se presentó en el gráfico de la derecha. Barra de escala en imágenes H&E, 100 μm. n = 4 fémures en el grupo control, n = 5 fémures en el grupo NTZ. f Pesos corporales de ratones en diferentes momentos después del tratamiento con NTZ o vehículo. Los datos se presentan como media ± SD. **, p < 0,01; ***, p < 0,001; según lo estimado por la prueba t de Student. NTZ, nitazoxanida

La diferenciación de osteoclastos es un mecanismo esencial para que Ac-KLF5 induzca la metástasis ósea en el cáncer de próstata [23]. Para determinar si NTZ atenúa la diferenciación de osteoclastos inducida por Ac-KLF5, primero probamos la citotoxicidad de NTZ en células RAW264.7, un modelo de línea celular de diferenciación de osteoclastos. En el ensayo de viabilidad de células CCK-8, NTZ no mostró citotoxicidad detectable en células RAW264.7 en concentraciones inferiores a 25 μM después de 48 h de tratamiento (Fig. 4a). Durante la diferenciación de osteoclastos inducida por RANKL en células RAW264.7, que duró 7 días, el tratamiento con NTZ disminuyó el número de células multinucleadas TRAP+ de manera dependiente de la dosis (Fig. 4b, c). Incluso 6.25 y 12.5 μM de NTZ, que no causaron citotoxicidad en las células RAW264.7 (Fig. 4a), aún redujeron significativamente el número de células multinucleadas TRAP+ (Fig. 4c). Por lo tanto, NTZ probablemente atenúa la diferenciación de osteoclastos.

La nitazoxanida atenúa la diferenciación de osteoclastos inducida por Ac-KLF5. a Efectos de NTZ a diferentes concentraciones sobre la viabilidad de las células RAW264.7 después de 48 h de tratamiento, según lo determinado por el ensayo CCK8. b, c NTZ inhibe la diferenciación de osteoclastos de forma dependiente de la dosis, según lo determinado por la tinción TRAP de células RAW264.7 tratadas con RANKL (50 ng/mL) y varias concentraciones de NTZ durante 5 días. Se muestran imágenes representativas de TRAP+ y células multinucleadas (núcleos >3) (b) y su número por pocillo (c). Se realizó un análisis ANOVA de una vía sobre los datos. d NTZ inhibió la diferenciación de osteoclastos de las células RAW264.7 causada por el medio acondicionado (CM) de las células PC-3-KQ, como lo indican las imágenes representativas de las células teñidas con TRAP (izquierda) y el número de células TRAP+ por pocillo (derecha) después tratamientos NTZ. Se realizó un análisis ANOVA de una vía sobre los datos. e NTZ inhibió la diferenciación de osteoclastos de células RAW264.7 cocultivadas con células PC-3-KQ, como lo indican las imágenes representativas de células teñidas con TRAP (izquierda) y el número de células TRAP+ por pocillo (derecha) después de los tratamientos con NTZ. Se realizó un análisis ANOVA de una vía sobre los datos. f NTZ disminuyó la cantidad de osteoclastos inducidos por Ac-KLF5 en huesos de ratón, como lo indican las imágenes de secciones óseas con células TRAP+ (izquierda) y la cantidad de osteoclastos (N.Oc) por mm de superficie ósea (BS). Barra de escala, 200 μm. Se realizó la prueba t de Student. n = 5 fémures en el grupo vehículo, n = 5 fémures en el grupo NTZ. Para todos los gráficos de barras, los datos se muestran como media ± SD. **, p < 0,01; ***, p < 0,001. T, células tumorales; B, hueso; MO, médula ósea; NTZ, nitazoxanida; RANKL, receptor activador del ligando del factor nuclear-κB; TRAP, fosfatasa ácida tartrato resistente

También recolectamos medios acondicionados (CM) de células PC-3-KQ tratadas con NTZ en concentraciones variables (0, 1.25, 2.5 y 5 μM) durante 36 h y usamos el CM para tratar células RAW264.7 en presencia de un RANKL más diluido (10 ng/mL) durante 7 días. El número de células multinucleadas TRAP+ se redujo significativamente con CM de las células tratadas con NTZ a 2,5 o 5 μM (Fig. 4d).

El tercer modelo para los osteoclastos inducidos por Ac-KLF5 fue el cultivo conjunto de células RAW264.7 con células PC-3-KQ en presencia de NTZ (0, 1,25, 2,5 y 5 μM) durante 7 días y la posterior TRAP tinción El cocultivo aumentó significativamente, mientras que el tratamiento con NTZ en las 3 concentraciones disminuyó significativamente el número de células multinucleadas TRAP+ (Fig. 4e). En los fémures de ratón, la tinción con TRAP reveló que el tratamiento con NTZ redujo significativamente el número de células TRAP+ en comparación con el grupo del vehículo (Fig. 4f).

MMP9 es fundamental en la metástasis del CaP [32], incluida la resorción ósea durante la metástasis ósea [33]. Descubrimos que el KLF5K369Q que imita a Ac-KLF55 indujo significativamente la expresión de MMP9 tanto a nivel de proteína como de ARNm en comparación con KLF5K369R deficiente en acetilación (archivo adicional 1: Fig. S6a, S6b) y que NTZ disminuyó la expresión de MMP9 de una manera dependiente de la dosis en Células que expresan KLF5K369Q (Archivo adicional 1: Fig. S6a, S6b). La disminución de la expresión de la proteína MMP9 por NTZ se confirmó en metástasis óseas inducidas por KLF5k369Q mediante tinción inmunohistoquímica (Archivo adicional 1: Fig. S6c). Por lo tanto, la inhibición de la metástasis ósea mediada por NTZ también puede implicar la regulación a la baja de MMP9 por parte de NTZ.

Para comprender cómo NTZ suprime la metástasis ósea inducida por KLF5K369Q, la secuenciación de ARN se realizó utilizando células PC-3-KQ y PC-3-KR en presencia o ausencia de NTZ (5 μM). Nos enfocamos en los genes cuyos patrones de expresión fueron modulados por KLF5K369Q, pero la modulación de KLF5K369Q fue revertida por el tratamiento con NTZ. En total, hubo 2836 genes expresados ​​​​diferencialmente entre KLF5K369Q y KLF5K369R, con 1779 regulados al alza y 1057 regulados a la baja por KLF5K369Q (Fig. 5a). Los patrones de expresión modulados por KLF5K369Q se revirtieron mediante el tratamiento con NTZ para 241 de 2836 genes expresados ​​diferencialmente. Los 241 genes incluían 127 regulados al alza y 114 regulados a la baja por KLF5K369Q (Fig. 5b, c; Archivo adicional 2: Tabla S3, Tabla S4).

La nitazoxanida revierte los efectos de Ac-KLF5 en la expresión de muchos genes en las células PC-3. a Gráficos volcánicos de todos los genes cuantificados de los perfiles de expresión génica entre KLF5K369Q y KLF5K369R en células PC-3. b Gráfico de dispersión de genes expresados ​​diferencialmente (DEG) entre células PC-3-KQ con y sin tratamiento con NTZ y DEG entre células PC-3-KQ y PC-3-KR. Los puntos en el cuadrante superior izquierdo representan genes que estaban regulados a la baja por KLF5K369Q pero regulados al alza por NTZ, mientras que los puntos en el cuadrante inferior derecho indican genes que estaban regulados al alza por KLF5K369Q pero regulados a la baja por NTZ en células PC-3. Se utilizó un valor de p ajustado <0,05 para definir todos los genes alterados. c Mapa de calor que muestra los DEG en los cuadrantes superior izquierdo e inferior derecho del panel A. La barra de color a la derecha indica cambios de pliegue log2 (Log2FC)

Evaluamos los genes 241 KLF5K369Q modulados y sensibles a NTZ para la asociación de sus niveles de expresión con la supervivencia del paciente en cáncer de próstata utilizando la base de datos SU2C. Los datos de supervivencia estaban disponibles para 119 de los 127 genes con regulación positiva y regulación negativa de NTZ de KLF5K369Q y 111 de los genes con regulación negativa de NTZ y regulación negativa de KLF5K369Q (archivo adicional 2: tabla S5). De los 119 genes KLF5K369Q regulados positivamente y NTZ regulados negativamente, solo la regulación positiva de MYBL2 y TIMM8A se asoció significativamente con un peor sistema operativo del paciente (Fig. 6a), un patrón consistente con la función de supresión de metástasis de NTZ. La regulación positiva de 5 genes, incluidos INHBB, COL4A6, CACNG8, PIANP y C2orf78, se asoció significativamente con un mejor sistema operativo en lugar de un peor sistema operativo (Archivo adicional 1: Fig. S7a). La regulación positiva de los 112 genes restantes no afectó significativamente la supervivencia del paciente (Archivo adicional 2: Tabla S5). Por lo tanto, es más probable que MYBL2 y TIMM8A medien la inducción de metástasis ósea por Ac-KLF5.

Asociación de genes sensibles a Ac-KLF5 y NTZ con la supervivencia del paciente. a Los niveles de expresión más altos de 7 genes se correlacionan con la supervivencia general (SG) en pacientes con cáncer de próstata, según lo determinado por el análisis de Kaplan-Meier utilizando el conjunto de datos SU2C. b Los niveles de expresión de 7 genes sensibles a Ac-KLF5 y NTZ se analizaron utilizando el conjunto de datos GSE21034 [29].

En el conjunto de datos GSE21034, los niveles de expresión de MYBL2 y TIMM8A estaban disponibles en tumores primarios, metástasis viscerales y metástasis óseas de cáncer de próstata [29]. Mientras que tanto MYBL2 como TIMM8A se expresaron en niveles más altos en metástasis que en tumores primarios cuando se combinaron metástasis viscerales y óseas (Fig. 6b), solo MYBL2 mostró un nivel de expresión significativamente más alto en metástasis óseas que en tumores primarios cuando las metástasis óseas se analizaron por separado. archivo 1: Fig. S7b).

De los 111 genes KLF5K369Q regulados negativamente y NTZ regulados positivamente en el conjunto de datos SU2C, los niveles más altos de TMPRSS2, CALB1, SPOCK2, COL4A4 y COL4A3 se asociaron significativamente con un mejor sistema operativo (Archivo adicional 1: Fig. 6a). Sin embargo, los niveles más altos de 2 genes (FTH1 y BDH1) se asociaron con una peor SG del paciente (Archivo adicional 1: Fig. S7a).

Además, probamos si Ac-KLF5 regula transcripcionalmente MYBL2 y TIMM8A. En células PC-3 y DU 145 que expresan diferentes formas de KLF5, la RT-PCR cuantitativa reveló que KLF5K369Q indujo significativamente MYBL2 en células PC-3 y DU 145, mientras que la inducción de TIMM8A no fue significativa (Fig. 7a; archivo 1: Fig. S8a). Cuando los siRNA derribaron KLF5 en células PC-3-KQ, la expresión de MYBL2 se redujo significativamente tanto a nivel de mRNA como de proteína (Fig. 7b; Archivo adicional 1: Fig. S8b, S8c). Recientemente se demostró que MYBL2 promueve la metástasis y la resistencia a la castración del cáncer de próstata [34]. Por lo tanto, nos enfocamos en la regulación transactivacional de MYBL2 por KLF5K369Q.

La nitazoxanida atenúa la regulación positiva de la expresión de MYBL2 por Ac-KLF5 en células de cáncer de próstata. a Expresión de MYBL2 y TIMM8A en células PC-3 y DU 145 que expresan diferentes formas de KLF5, según lo determinado mediante qPCR. Se usaron líneas celulares C4-2B y PC-3 parentales como controles, y se usó GAPDH como control de carga. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA unidireccional con comparaciones múltiples. b Las células se transfectaron con siKLF5 50 nM concomitantemente con o sin tratamiento con NTZ (5 μM) durante 24 h y luego se procesaron qPCR en tiempo real. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA unidireccional con comparaciones múltiples. c NTZ reguló a la baja la expresión de MYBL2 en células PC-3-KQ y células DU 145-KQ a niveles de ARNm, según lo detectado por qPCR. Los tratamientos con NTZ se realizaron a las concentraciones indicadas durante 48 h. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA unidireccional con comparaciones múltiples. El tratamiento con d NTZ en ratones redujo la expresión de MYBL2 en la metástasis ósea de PC-3-KQ, según lo detectado por la tinción IHC y lo indicado por las imágenes IHC y las intensidades de las señales de tinción. n = 5 tumores para cada grupo. Se realizó la prueba t de Student. Barra de escala, 200 μm. e El promotor del gen MYBL2 contenía múltiples sitios potenciales de unión a KLF5, como predijo el programa JASPAR. f, g NTZ tuvo diferentes efectos en la unión de Ac-KLF5 a diferentes sitios de unión de Ac-KLF5 del promotor del gen MYBL2, según lo determinado por ChIP y RT-PCR regular (f) o qPCR en tiempo real (g) usando PC -Células 3-KQ tratadas con NTZ durante 48 h y células PC-3-KR. Todos los gráficos de barras se muestran como media ± SD de tres experimentos independientes. *, p < 0,05; **, p < 0,01; ***, p < 0,001; ns, no estadísticamente significativo

Tanto en las células PC-3 como en las DU 145 que expresan KLF5K369Q, el tratamiento con NTZ redujo la expresión de MYBL2 tanto en el ARNm como en la proteína de manera dependiente de la dosis o del tiempo (Fig. 7c; Archivo adicional 1: Fig. S8d, Fig. S8e) . Como reveló la tinción inmunohistoquímica, el tratamiento con NTZ en ratones también disminuyó significativamente la expresión de la proteína MYBL2 en los tejidos óseos (Fig. 7d).

Para probar más a fondo el efecto de NTZ en la transcripción de MYBL2 inducida por Ac-KLF5, analizamos la secuencia promotora de MYBL2 usando el software Jaspar para identificar los sitios de unión potenciales de KLF5 (Fig. 7e) y realizamos ChIP-PCR usando cebadores que abarcan los 6 potenciales Sitios de unión de KLF5 con las puntuaciones de unión más altas. Para los 5 sitios de unión potenciales entre -80 y -130 nucleótidos, no se detectó una unión evidente usando 2 pares de cebadores (Fig. 7f). Para el posible sitio de unión entre -1242 y -1251 nucleótidos, CHIP-PCR reveló una ocupación evidente de KLF5K369Q pero no de KLF5K369R en el promotor MYBL2. El tratamiento con NTZ disminuyó significativamente el ADN unido a KLF5K369Q (Fig. 7f y g).

Probamos si NTZ se une directamente a la proteína KLF5 usando diferentes ensayos (Fig. 8). En el ensayo de extinción de la fluorescencia, NTZ redujo la intensidad de la fluorescencia de KLF5, KLF5K369Q y KLF5K369R de forma dependiente de la dosis (Fig. 8a), con una constante de unión Kd de 7,2, 5,4 y 7,3 μM, respectivamente (Fig. 8b) . En la espectroscopia de CD, las tres formas de KLF5 exhibieron picos negativos entre 205 nm y 220 nm, lo que indica modificaciones en la estructura secundaria de una proteína [35]. El tratamiento con NTZ disminuyó la intensidad de estos picos negativos sin cambiar la forma del espectro (Fig. 8c), lo que sugiere una pérdida de estructuras de hélice α. El análisis de HPLC también confirmó que NTZ se une a la proteína KLF5 independientemente del estado de acetilación de KLF5 (Fig. 8d).

NTZ se une a la proteína KLF5 independientemente de su estado de acetilación. a Las intensidades de fluorescencia de las proteínas KLF5, KLF5K369Q y KLF5K369R se midieron después de la incubación con diferentes concentraciones de NTZ. b Cálculo de los valores de Kd para la constante de disociación utilizando el software Origin y ajustando los datos de extinción de la fluorescencia. c Espectros de dicroísmo circular (CD) de KLF5, KLF5K369Q y KLF5K369R incubados con NTZ. Las concentraciones de ambas proteínas y NTZ son 0,2 μM. d Unión de NTZ a las diferentes formas purificadas de proteínas KLF5 mediante análisis HPLC

En estos ensayos de unión a proteínas y fármacos, utilizamos el retinoide sintético Am80 como control negativo, ya que Am80 se une a RARα para promover su asociación con KLF5 en la regulación génica sin unión directa a KLF5 [36]. Am80 no se unió a ninguna forma de la proteína KLF5 en el ensayo de extinción de la fluorescencia, ya que la Kd fue superior a 30 μM (archivo adicional 1: Fig. S9a y S9b). Am80 tampoco cambió la estructura secundaria de KLF5, independientemente del tratamiento NTZ (Archivo adicional 1: Fig. S9c).

Los hallazgos de este estudio presentan a la nitazoxanida (NTZ), un fármaco actualmente aprobado para el tratamiento de infecciones virales y parasitarias [37, 38], como agente terapéutico potencial para tratar la metástasis ósea del CaP. La evidencia directa para esta conclusión provino de los experimentos con animales, donde el tratamiento con NTZ suprimió drásticamente la formación de metástasis óseas en un modelo de ratón establecido, es decir, metástasis óseas inducidas por KLF5K369Q (Figs. 2 y 3). La inhibición de la metástasis ósea fue eficaz tanto en el modo preventivo como en el terapéutico, ya que se observaron eficacias similares cuando se administró NTZ al mismo tiempo que la inoculación celular (Fig. 2) o una semana después (Fig. 3).

Los cánceres de próstata, mama y pulmón a menudo metastatizan en los huesos [39,40,41]. Mientras que los cánceres de mama y pulmón en su mayoría sufren metástasis osteolíticas, el cáncer de próstata causa lesiones tanto osteolíticas como osteoblásticas [39,40,41]. Varios factores afectan el equilibrio entre las actividades proosteoclásticas y proosteoblásticas de las células de cáncer de próstata [40, 41]. Por ejemplo, en el microambiente óseo, las células de cáncer de próstata secretan factores solubles relacionados con los huesos, como RANKL y M-CSF, para activar los osteoclastos; y los osteoclastos, a su vez, liberan TGF-β e IGF-1 para apoyar el crecimiento de las células de cáncer de próstata [40, 41]. Además, los osteoclastos liberan factores osteolíticos como el péptido relacionado con la hormona paratiroidea (PTHrP) para promover la diferenciación y la supervivencia de los osteoblastos [39, 40]. Por lo tanto, la diferenciación de osteoclastos juega un papel importante en la metástasis ósea del cáncer de próstata, y la inhibición de la diferenciación de osteoclastos puede atenuar eficazmente la metástasis ósea del cáncer de próstata. Nuestro estudio anterior demostró que la diferenciación de osteoclastos es un mecanismo celular para que KLF5K369Q induzca metástasis óseas osteolíticas en el cáncer de próstata [23]. Incluso en las células C4-2B, que promueven principalmente lesiones osteoblásticas en el hueso [42], la expresión ectópica de KLF5K369Q o KLF5 aún causaba lesión ósea osteolítica [23]. De acuerdo con su efecto terapéutico sobre la metástasis ósea, el tratamiento con NTZ atenuó la diferenciación de osteoclastos inducida por KLF5K369Q. Dicho efecto inhibidor se demostró por primera vez en un modelo in vitro de diferenciación de osteoclastos, es decir, células RAW264.7 tratadas con RANKL o cocultivadas con células cancerosas que expresan KLF5K369Q (Fig. 4b-e). El efecto inhibitorio de NTZ sobre los osteoclastos también se confirmó en el modelo de ratón (Fig. 4f). Vale la pena señalar que incluso a concentraciones que no mostraron citotoxicidad para las células RAW264.7 (Fig. 4a), NTZ aún disminuyó los osteoclastos (Fig. 4b, c). Sin embargo, considerando que el cáncer de próstata induce con mayor frecuencia lesiones osteoblásticas, es importante investigar si la NTZ también inhibe la diferenciación y función de los osteoblastos.

La inhibición de la diferenciación de osteoclastos inducida por KLF5K369Q in vitro e in vivo es consistente con un estudio reciente en el que NTZ reduce la pérdida ósea en ratones ovariectomizados al inhibir la osteoclastogénesis inducida por RANKL [43].

A nivel molecular, parece que NTZ modula directamente la función de KLF5K369Q en la transcripción de genes para inhibir la metástasis ósea. KLF5 es un factor de transcripción, y la metástasis ósea mediada por KLF5K369Q está mediada por una serie de genes regulados transcripcionalmente por KLF5K369Q, incluidos CXCR4, IL11 y otros [23]. KLF5K369Q regulaba al alza o a la baja los genes 2836 en comparación con KLF5K369R (Fig. 5a). El tratamiento con NTZ revirtió la regulación positiva o negativa de 241 genes por KLF5K369Q (Fig. 5b, c; Archivo adicional 2: Tabla S3, Tabla S4). Estos hallazgos indican que NTZ cambia la función de KLF5K369Q en la transcripción de muchos genes.

Múltiples genes podrían mediar el efecto de NTZ en la metástasis ósea mediada por KLF5K369Q. Por ejemplo, dos genes regulados positivamente por Ac-KLF5 y regulados negativamente por NTZ, MYBL2 y TIMM8A, se regularon positivamente en el cáncer de próstata humano. Su regulación positiva se asoció significativamente con una peor supervivencia general en pacientes con cáncer de próstata (Fig. 6a). También hubo 5 genes regulados negativamente por KLF5K369Q y regulados positivamente por NTZ cuyos niveles de expresión más bajos en los cánceres de próstata humanos también se asociaron significativamente con una peor supervivencia general, incluidos TMPRSS2, CALB1, SPOCK2, COL4A4 y COL4A3 (Fig. 6a). Es más probable que estos 7 genes tengan un impacto en el papel promotor de KLF5K369Q en la metástasis ósea, además de CXCR4 e IL11 descritos en un estudio anterior [23].

Entre los 7 genes regulados por KLF5K369Q y sensibles a NTZ, el MYBL2 (proteína B relacionada con Myb) es particularmente interesante, ya que un estudio anterior demostró que MYBL2 promueve el crecimiento resistente a la castración y la metástasis ósea del cáncer de próstata [34]. Además, dirigirse a MYBL2 bloquea la metástasis ósea en las células de cáncer de próstata, y los niveles más altos de expresión de MYBL2 se asocian con un estadio tumoral más alto, un grado tumoral más alto, un riesgo más alto de recaída metastásica y un peor pronóstico en pacientes con cáncer de próstata [34]. MYBL2 regula la progresión del ciclo celular, la supervivencia y la diferenciación en las células cancerosas [44]. Descubrimos que el gen MYBL2 fue activado transcripcionalmente por KLF5K369Q en células de cáncer de próstata. Por ejemplo, KLF5K369Q aumentó mientras que su silenciamiento redujo la expresión de MYBL2, y KLF5K369Q se unió a secuencias específicas del promotor de MYBL2 para activar su transcripción mientras que KLF5K369R no lo hizo (Fig. 7; Archivo adicional 1: Fig. S8). Además, el tratamiento con NTZ redujo la expresión de MYBL2 tanto en células cultivadas como en tumores desarrollados en ratones y comprometió la unión de KLF5K369Q al promotor de MYBL2 (Fig. 7).

También vale la pena señalar que KLF5K369Q aumentó la expresión de MMP9, y la regulación positiva fue atenuada por el tratamiento con NTZ (Archivo adicional 2: Tabla S4; Archivo adicional 1: Fig. S6). Los osteoclastos activados producen ácido y proteinasas como las metaloproteinasas de matriz (MMP) para degradar la matriz ósea, liberando más TGF-β y otros factores de crecimiento en el hueso. Dichos factores, a su vez, estimulan la metástasis ósea, lo que da como resultado el llamado círculo vicioso [45]. La inhibición de la expresión de MMP9 por NTZ en células que expresan KLF5K369Q también podría contribuir a la inhibición de la metástasis ósea por NTZ.

NTZ parece actuar directamente sobre la proteína KLF5 para modular sus funciones, como lo revelan diferentes ensayos de unión de fármaco a proteína (Fig. 8). Si bien NTZ se une a la molécula KLF5, la unión no parece ser específica de KLF5K369Q, ya que KLF5 y KLF5K369R también mostraron capacidades de unión similares (Fig. 8). Queda por determinar cómo actúa NTZ en KLF5 y si tal acto afecta directamente la función de KLF5 en la transcripción de genes.

El efecto inhibidor de la NTZ sobre la metástasis ósea podría aplicarse a otros tipos de neoplasias malignas en las que la metástasis ósea se produce con frecuencia y el TGF-β es un inductor, incluidos los carcinomas de mama, pulmón y próstata y el mieloma múltiple [46, 47]. Anteriormente informamos que TGF-β induce la acetilación de KLF5 en células epiteliales, y la acetilación de KLF5 es esencial para que TGF-β regule la expresión génica y múltiples procesos celulares como la proliferación celular y EMT [17, 18, 20, 23, 48 ]. El mutante KLF5K369Q que imita a Ac-KLF5 mantiene la EMT, promueve la invasión celular e induce la metástasis ósea en las células de cáncer de próstata [23]. Por lo tanto, el efecto terapéutico de NTZ sobre la metástasis ósea inducida por KLF5K369Q establecido en este estudio también debería aplicarse a la metástasis ósea inducida por TGF-β en otros tipos de neoplasias malignas.

Otros fármacos que también suprimieron la invasión de células que expresan KLF5K369Q en el ensayo de invasión de células esferoides también podrían ser capaces de suprimir la metástasis ósea. La estrategia de detección fue desarrollada por Cribbes et al. previamente [24]. El descubrimiento de la actividad supresora de NTZ en la metástasis ósea valida esta estrategia de detección con células que expresan KLF5K369Q (Fig. 1). Además de NTZ, otros 5 fármacos también inhibieron la invasión de esferoides celulares en más del 50 % a 0,1 μM. Incluyeron nifuratel, mitomicina C, ronidazol, retapamulina y furagina (Fig. 1d, Tabla 1). Si bien la mitomicina C se usa ampliamente en el tratamiento de la metástasis [49, 50] y el ronidazol actúa como un agente veterinario, ninguno de los 3 medicamentos restantes se ha implicado en la metástasis del cáncer en la literatura. Por lo tanto, vale la pena probar estos 3 fármacos por sus posibles funciones terapéuticas en la metástasis ósea.

La NTZ está aprobada para el tratamiento de diversas enfermedades infecciosas, incluidas las infecciones por protozoos, antihelmínticos, virales y bacterianas [51]. Aunque nuestro estudio es el primero en demostrar un efecto terapéutico de NTZ en la metástasis ósea del cáncer de próstata, su actividad anticancerígena se ha informado en estudios recientes en diferentes tipos de cánceres que involucran varios mecanismos moleculares. Por ejemplo, suprimió el crecimiento del tumor de colon probablemente al inducir la detención del ciclo celular y alterar la expresión de múltiples moléculas [52, 53]; suprimió parcialmente el crecimiento del cáncer de ovario al inhibir la actividad de la proteína disulfuro isomerasa (PDI) [54]; inhibió la formación de esferas en cultivos 3D de células HCC y CRC que involucran la inhibición de OXPHOS [55, 56]; y suprimió el crecimiento del glioma al provocar la detención del ciclo celular G2/M, inducir la apoptosis e inhibir la autofagia probablemente a través de la inhibición de CDK1, la regulación positiva de ING1, etc. [57, 58]. NTZ también podría prevenir la inducción de tumores mamarios por MNU en ratas [59].

A nivel molecular, estudios previos sugieren que NTZ podría afectar las funciones de múltiples moléculas y modular varias vías de señalización [51]. Por ejemplo, NTZ se identificó como un inhibidor de MYC en células de cáncer de mama utilizando un sistema de detección HTS [60]; NTZ podría actuar como un inhibidor moderado de la vía STAT3 [61]; la inhibición de la actividad de señalización de Wnt por parte de NTZ podría ser independiente de APC, pero implica la orientación de PAD2 y el posterior aumento en la desaminación y el recambio de β-catenina en células de cáncer de colon [62]. Los análisis bioinformáticos sugieren que en las células de HCC, NTZ podría dirigirse a muchas moléculas, procesos biológicos y vías de señalización [63]. La inducción de la muerte celular por NTZ y algunos de sus derivados también implica dirigirse al proteasoma 20S [64].

En resumen, adoptamos el ensayo de detección de invasión de esferoides desarrollado recientemente para identificar medicamentos aprobados por la FDA que se dirigen a la metástasis ósea inducida por KLF5 acetilado en el cáncer de próstata. Seis de los fármacos de 1987 inhibieron la invasión de esferoides celulares en más del 50 % a 0,1 μM. Incluyeron nitazoxanida, nifuratel, mitomicina C, ronidazol, retapamulina y furagina. Los experimentos funcionales revelaron que NTZ suprimió la metástasis ósea inducida por KLF5K369Q tanto en modo preventivo como terapéutico en ratones. NTZ inhibió la osteoclastogénesis, un proceso celular responsable de la metástasis ósea inducida por KLF5K369Q. Mecánicamente, NTZ se unió a la molécula KLF5 e invirtió la función de KLF5K369Q en la transcripción de muchos genes. Dos genes regulados positivamente por KLF5K369Q y regulados negativamente por NTZ, MYBL2 y TIMM8A, se regularon positivamente en el cáncer de próstata humano, y la regulación positiva se asoció con una peor supervivencia del paciente. La regulación positiva de MYBL2 por KLF5K369Q involucró la unión directa del promotor y NTZ atenuó la unión. Estos hallazgos presentan a NTZ como un agente terapéutico potencial para la metástasis ósea inducida por Ac-KLF5 en el cáncer de próstata.

Los datos que respaldan este estudio, incluidos los resultados de la pantalla de la biblioteca compuesta y los resultados del análisis de secuenciación de ARN, se incluyen en los archivos de datos complementarios. El conjunto de datos analizado durante el estudio actual está disponible a través del repositorio NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) con el número de acceso. GSE21034, https://identifiers.org/geo:GSE21034. Los datos de secuencia sin procesar en este estudio se han depositado en GEO con el número de acceso GSE216126 y el enlace web para este estudio es https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/?term=GSE216126.

Factor 5 similar a Krüppel

Acetilado KLF5

Acetilado KLF5

KLF5 desacetilado

Cancer de prostata

Cáncer de próstata metastásico resistente a la castración

Transformando el factor de crecimiento-β

Transformación epitelial-mesenquimatosa

Dimetilsulfóxido

Administración de Alimentos y Medicamentos

nitazoxanida

Kit de conteo de células-8

Carboximetilcelulosa de sodio

Activador del receptor del factor nuclear-κB

Fosfatasa ácida tartrato resistente

Tasa de descubrimiento falso

Stand Up to Cancer/Fundación para el Cáncer de Próstata

Eventos relacionados con el esqueleto

Concentración inhibitoria media máxima

Densidad óptica

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Agradecemos a los miembros del personal del Centro de Animales de Laboratorio de la Universidad de Ciencia y Tecnología del Sur por brindar apoyo en los estudios con animales.

Este estudio cuenta con el apoyo de la subvención JCYJ20200109141229255 de la Comisión de Ciencia, Tecnología e Innovación del Municipio de Shenzhen.

Qingqing Huang y Mingcheng Liu contribuyeron igualmente a este trabajo.

Departamento de Biología Celular Humana y Genética, Facultad de Medicina, Universidad de Ciencia y Tecnología del Sur, 1088 Xueyuan Blvd, Shenzhen, 518055, China

Qingqing Huang, Mingcheng Liu, Dúo Zhang, Bing-Biao Lin, Xing Fu, Zhiqian Zhang, Baotong Zhang y Jin-Tang Dong

Departamento de Urología, Centro de Riñón y Urología, Centro de Trastornos del Piso Pélvico, Séptimo Hospital Afiliado, Universidad Sun Yat-sen, Shenzhen, 518000, China

Bing Biao Lin

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QH, ML y JTD diseñaron los experimentos; QH y ML realizaron la mayoría de los experimentos y DZ purificó las proteínas KLF5 y ayudó en los ensayos de interacción fármaco-proteína; QH analizó los datos experimentales; BL y XF realizaron análisis bioinformáticos; QH, JTD, ML y BL escribieron, revisaron y revisaron el manuscrito; BZ y ZZ ayudaron en el diseño de algunos experimentos; y JTD concibió el proyecto, supervisó el estudio, brindó orientación general y finalizó el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Jin-Tang Dong.

Todos los ratones se mantuvieron y manipularon siguiendo la guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Los experimentos con animales se realizaron con la aprobación del Comité de Ética de Animales de Laboratorio de la Universidad de Ciencia y Tecnología del Sur (Número de aprobación: SUSTC-JY2019030-1).

No aplica.

Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Comparación de la capacidad de migración e invasión entre diferentes formas de células que expresan KLF5, en relación con la Fig. 1. Figura S2. El efecto de NTZ en la invasión de células KLF5 acetiladas (KQ) y no mutadas, relacionado con la Fig. 1. Figura S3. El efecto de NTZ sobre la proliferación celular en células que expresan KLF5 acetilado, relacionado con la Fig. 1. Figura S4. NTZ no causó toxicidad notable in vivo, en relación con la Fig. 2. Figura S5. Imágenes representativas de BL de cada ratón en el día 7 (izquierda) y análisis de intensidad de BL (derecha), relacionado con la Fig. 3. Figura S6. NTZ regulaba a la baja la expresión de MMP9 inducida por KLF5 acetilado. Figura S7. Genes diferenciales entre los grupos KQ-Ctrl y KR-Ctrl y análisis de supervivencia global de 7 genes diferenciales, Fig. 5 y Fig. 6 relacionadas. Figura S8. La nitazoxanida reduce la producción de MYBL2 inducida por KLF5 acetilado, en relación con la Fig. 7. Figura S9. Am80 como control negativo no se une a las proteínas KLF5, KLF5K369Q y KLF5K369R, en relación con la Fig. 8.

Detección secundaria de drogas de 87 compuestos exitosos. Tabla S2. Tercera detección de drogas de 25 compuestos exitosos. Tabla S3. Genes diferenciales afectados por NTZ en RNA-Seq. Tabla S4. TPM de células PC-3 con KR y KQ en presencia o ausencia de NTZ en RNA-Seq. Tabla S5. La importancia de la supervivencia general de los genes regulados negativamente por NTZ o los genes regulados positivamente por NTZ en la base de datos SU2C.

Las imágenes de inmunotransferencia o geles sin recortar.

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Reimpresiones y permisos

Huang, Q., Liu, M., Zhang, D. et al. La nitazoxanida inhibe la metástasis ósea inducida por KLF5 acetilado mediante la modulación de la función de KLF5 en el cáncer de próstata. BMC Med 21, 68 (2023). https://doi.org/10.1186/s12916-023-02763-4

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Recibido: 26 Octubre 2022

Aceptado: 30 de enero de 2023

Publicado: 21 febrero 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s12916-023-02763-4

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