Vaccinia E5 es un importante inhibidor del sensor de ADN cGAS

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 2898 (2023) Citar este artículo

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El sensor de ADN GMP-AMP sintasa cíclica (cGAS) es fundamental en la inmunidad antiviral del huésped. El virus vaccinia (VACV) es un gran virus de ADN citoplasmático que pertenece a la familia de los poxvirus. No se comprende bien cómo el virus vaccinia antagoniza la vía de detección de ADN citosólico mediada por cGAS. En este estudio, examinamos 80 genes de vaccinia para identificar posibles inhibidores virales de la vía cGAS/Stimulator of interferon gene (STING). Descubrimos que vaccinia E5 es un factor de virulencia y un importante inhibidor de cGAS. E5 es responsable de abolir la producción de cGAMP durante la infección de células dendríticas por el virus vaccinia (cepa Western Reserve). E5 se localiza en el citoplasma y el núcleo de las células infectadas. El E5 citosólico desencadena la ubiquitinación de cGAS y la degradación dependiente del proteasoma al interactuar con cGAS. La eliminación del gen E5R del genoma del virus vaccinia modificado Ankara (MVA) induce fuertemente la producción de IFN tipo I por parte de las células dendríticas (DC) y promueve la maduración de DC y, por lo tanto, mejora las respuestas de células T específicas de antígeno.

La GMP-AMP sintasa cíclica (cGAS) es un importante sensor de ADN fundamental para la inmunidad innata antitumoral y antiviral, así como para las enfermedades inflamatorias autoinmunes1,2,3,4. Una vez activado por el ADN citosólico, cGAS genera GMP-AMP cíclico (cGAMP), que a su vez se une a una proteína STING localizada en el retículo endoplásmico, lo que da como resultado la activación de la vía TBK1/IRF3/IFNB. En consecuencia, los virus han evolucionado para emplear muchas estrategias para evadir esta importante vía antiviral5,6,7,8.

Los poxvirus son grandes virus de ADN citoplasmático que son importantes patógenos humanos y veterinarios, así como agentes oncolíticos y vectores virales9,10,11. El virus vaccinia (VACV) se utilizó con éxito como vacuna para la erradicación de la viruela. Sin embargo, la infección directa de células dendríticas (DC) con vaccinia da como resultado la inhibición de las respuestas inmunitarias tanto innata como adaptativa12,13,14. El virus vaccinia modificado Ankara (MVA) es una cepa de vaccinia altamente atenuada con deleción de grandes fragmentos de su genoma original de vaccinia luego de más de 570 pases en serie en fibroblastos de embrión de pollo, lo que lo hace no replicativo en la mayoría de las células de mamíferos15,16. MVA es un importante vector de vacunas y recientemente se aprobó como vacuna de segunda generación contra la viruela y la viruela del simio10,17.

cGAS es importante para la defensa del huésped contra la infección por poxvirus. Los ratones deficientes en cGAS son más susceptibles a la infección intranasal con el virus VACV2 y a la inoculación en la planta del pie con el virus de la ectromelia, un poxvirus específico del ratón18. Recientemente se descubrió que el gen B2R de Vaccinia codifica una nucleasa cGAMP citosólica (renombrada como poxina), y la eliminación de B2R de la vacuna vacuna contra el virus de la vaca resultó en una atenuación en el modelo de escarificación de la piel (SS)19. Sin embargo, aún se desconoce si los poxvirus codifican uno o más inhibidores directos de cGAS.

En este estudio, realizamos una pantalla de 80 genes virales de vaccinia para la inhibición de la vía cGAS/STING utilizando un ensayo de indicador de luciferasa dual e identificamos varios genes de vaccinia que codifican proteínas involucradas en la regulación negativa de la vía cGAS/STING/IFNB. Aquí mostramos que E5 (codificado por el gen E5R), una proteína que contiene el dominio BEN conservada entre los ortopoxvirus20, es un factor de virulencia y un inhibidor principal de cGAS. E5 interactúa con cGAS citoplasmático y desencadena su degradación de manera dependiente del proteasoma.

El virus Vaccinia es un gran virus de ADN citoplasmático con un genoma de 190 kilopares de bases (kpb) que codifica más de 200 proteínas21,22. MVA tiene una deleción de aproximadamente 30 kpb de su genoma vaccinia original, lo que resulta en la pérdida de muchos genes virales inmunomoduladores15. La infección por MVA de BMDC indujo la secreción de IFN-β y la producción de cGAMP, mientras que la infección con la cepa WR de vaccinia de tipo salvaje (WT VACV) no lo hizo (Fig. 1a, b). Estos resultados sugieren que WT VACV podría codificar uno o más inhibidores virales para bloquear la activación de cGAS y la producción de IFN-β aguas abajo.

un análisis ELISA de los niveles de IFN-β en los sobrenadantes de BMDC infectados con WT VACV o MVA a una MOI de 10 durante 16 h. Los lisados ​​celulares se analizaron mediante inmunotransferencia. n = 3 muestras independientes. b Niveles de cGAMP en BMDC infectados con WT VACV o MVA a una MOI de 10. Las células se recolectaron a las 2 y 8 h después de la infección. Los niveles de cGAMP se midieron por LC-MS. c Inmunotransferencia de cGAS, C7 y E3 en BMDC de ratones WT o cGas-/- infectados con diferentes virus vaccinia a una MOI de 10 durante 16 h. d Análisis ELISA de los niveles de IFN-β en BMDC de ratones WT o cGas-/- infectados con diferentes virus vaccinia a una MOI de 10 durante 16 h. n = 3 muestras independientes. e Análisis ELISA de los niveles de cGAMP en BMDC WT infectadas con WT VACV o VACVΔE5R a una MOI de 10 durante 16 h. n = 3 muestras independientes. Se utilizó la prueba t de Student no pareada de dos colas para las comparaciones de dos grupos en los estudios. Los datos son representativos de dos experimentos independientes y se presentan como media ± SEM. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para identificar posibles inhibidores de cGAS del genoma de vaccinia, primero seleccionamos 80 genes virales, que incluyen principalmente los que se expresan en momentos tempranos durante la infección por vaccinia21, con el razonamiento de que los antagonistas de la inmunidad innata probablemente estén codificados por genes virales tempranos. Luego se realizó un ensayo de luciferasa dual para detectar la capacidad de estas proteínas virales para inhibir la vía de detección de ADN citosólico mediada por cGAS/STING. Se han utilizado con éxito estrategias similares para detectar inhibidores de esta vía en otros virus de ADN, como se informó anteriormente5,23. En nuestro sistema, la transfección de células T HEK293 con 10 ng de STING tuvo un efecto limitado de inducción del promotor de IFNB, mientras que la transfección con 25 ng de STING mejoró la señal de luciferasa de luciérnaga de IFNB, lo que sugiere que una gran cantidad de STING sola sin cGAS podría producir una señal de luciferasa (Fig. 1a). Por lo tanto, utilizamos la cotransfección de STING (10 ng) y cGAS (50 ng) en nuestra pantalla con la intención de seleccionar posibles inhibidores de cGAS (Figuras complementarias 1b, c). El adenovirus E1A codifica un inhibidor conocido de STING6, y nuestro grupo informó recientemente que el gen C7L de vaccinia codifica un inhibidor de la vía IRF3/IFNB al prevenir la fosforilación de IRF324. Aquí mostramos que la cotransfección de E1A o C7L con STING (10 ng) y cGAS (50 ng) resultó en la inhibición de la señal de luciferasa de IFNB-luciérnaga (Fig. 1b complementaria). Por lo tanto, fueron seleccionados como controles positivos para la pantalla. Para la pantalla real, las células HEK293T se transfectaron con plásmidos que expresan un indicador de luciferasa de luciérnaga IFNB, un plásmido de control pRL-TK que expresa luciferasa de Renilla, cGAS (50 ng), STING (10 ng) y genes virales de vaccinia individuales como se indica, como así como E1A y C7R (Fig. 1c complementaria). Este ensayo identificó varios genes tempranos virales de vaccinia (E5R, K7R, B14R, C11R, WR199/B18R, WR200/B19R, E4L) como posibles inhibidores de la vía cGAS/STING (Figuras complementarias 1c, d). Para probar si alguno de los inhibidores candidatos atenúa la activación del promotor de IFNB mediada por STING, cotransfectamos genes candidatos individuales junto con STING en una cantidad mayor (50 ng), lo que provoca la inducción del promotor de IFNB sin cGAS. Descubrimos que la sobreexpresión de todos los candidatos, excepto B14R, tuvo poco efecto sobre la actividad del promotor de IFNB inducida por STING (50 ng), lo que sugiere que B14 podría apuntar a STING o sus vías de señalización aguas abajo, mientras que otros candidatos podrían apuntar a cGAS (Fig. 1e complementaria). ). Entre estos genes, se sabe que WR200/B19R codifica una proteína de unión a IFN de tipo I25. Aunque K7, B14 y C11 se han descrito como factores de virulencia de vaccinia26,27,28, y se informó que WR199/B18R codifica un factor de rango de huéspedes29,30, no está claro cómo evaden la vía del IFN tipo I. E4L codifica la subunidad RPO30 de la ARN polimerasa de vaccinia y un factor de transcripción intermedio31,32. Si bien se informó que E5 era una proteína viral temprana asociada con los virosomas (fábricas virales)33, se desconoce si desempeña o no un papel en la evasión inmune.

Planteamos la hipótesis de que eliminar un inhibidor importante de la vía cGAS/STING del genoma del VVAC daría como resultado una mayor inducción de IFN tipo I que otros mutantes de eliminación o el virus parental. Para probar esta idea, generamos una serie de virus VACV recombinantes con deleciones de inhibidores virales candidatos individuales, incluidos VACV∆E5R, VACV∆B2R, VACV∆E3L, VACV∆C11R, VACV∆WR199, y VACV∆C7L. Los BMDC WT y cGAS-/- se infectaron con WT VACV y los mutantes de deleción. Se determinó la expresión de las proteínas virales C7 y E3 para verificar la infección viral (Fig. 1c). Las concentraciones de IFN-β en los sobrenadantes de BMDC infectados se determinaron mediante ELISA. La infección por VACV WT de BMDC no logró inducir la producción de IFN-β. Entre todos los mutantes de deleción, solo VACV∆E5R indujo la secreción de IFN-β de las BMDC WT, pero no de las BMDC cGAS-/- (Fig. 1d). VACV∆E5R-E5R-Flag en el que E5R fue reemplazado por E5R-Flag no logró inducir la secreción de IFN-β, lo que significa que E5R-Flag es biológicamente activo (Fig. 1d). Además, aunque B2 (codificado por el gen B2R) se identificó como una nucleasa cGAMP19, la infección por VACV∆B2R no indujo la secreción de IFN-β de las BMDC WT (Fig. 1d), lo que sugiere la presencia de otros inhibidores virales de cGAS/STING. Vía /IFNB en VACV∆B2R. Además, la infección por VACV∆E5R de WT BMDC indujo la producción de cGAMP, lo que indica la activación de cGAS (Fig. 1e). Estos resultados demuestran que vaccinia E5R codifica un inhibidor principal de cGAS.

Vaccinia E5 es un polipéptido de 341 aminoácidos que comprende un dominio helicoidal alfa N-terminal (aminoácidos 60-106) y dos dominios BEN en el extremo C-terminal (aminoácido 112-222 y aminoácido 233-328) (Fig. .2a). BEN recibió su nombre por su presencia en BANP/SMAR1, poxvirus E5R y NAC120, y las proteínas que contienen el dominio BEN funcionan en la unión al ADN, la organización de la cromatina y la represión transcripcional34,35,36. E5R se conserva entre los ortopoxvirus (Fig. 2b. c complementaria), pero menos entre los yatapoxvirus y el virus del mixoma. Sin embargo, los ortólogos E5R están ausentes en los virus parapoxvirus, entomopoxvirus, viruela aviar y molusco contagioso (datos no mostrados). Las proteínas E5 de vaccinia (cepa Western Reserve (WR) y cepa Copenhagen), variola (el agente causante de la viruela) y virus de la viruela bovina contienen una secuencia adicional de 10 aminoácidos en el extremo N en comparación con las proteínas E5 de vaccinia (Ankara ), MVA y ectromelia (ratonera) (Fig. 2c complementaria). Curiosamente, Monkeypox E5 tiene grandes deleciones en sus terminales N y C (Figura complementaria 2c)37.

Para probar si vaccinia E5 es un factor de virulencia, realizamos un experimento de infección intranasal con WT VACV o VACV∆E5R (2 × 106 pfu) en ratones WT C57BL/6J. Todos los ratones infectados con WT VACV perdieron peso rápidamente, a partir del tercer día de infección, y murieron o fueron sacrificados debido a una pérdida de peso de más del 30 % en los días 7 a 8 posteriores a la infección (Fig. 2a, b). Por el contrario, los ratones infectados con VACV∆E5R perdieron cerca del 15 % del peso corporal inicial en promedio el día 6 después de la infección y luego se recuperaron (Fig. 2a, b). Para descartar la posibilidad de que VACV∆E5R tenga atenuación en la replicación, comparamos los tamaños de placa y la cinética de replicación entre WT VACV y VACV∆E5R en células BSC40. Descubrimos que VACV∆E5R era competente para la replicación y exhibió una cinética de replicación similar a la de WT VACV in vitro (Figuras complementarias 3a, b). Sin embargo, la infección intranasal de WT VACV a 2 × 105 ufp resultó en títulos mucho más altos en los pulmones, bazos, hígados y sangre infectados en el día 6 después de la infección en comparación con los tejidos extraídos de VACV∆E5R (2 × 107 ufp)- ratones C57BL / 6J infectados en el día 6 después de la infección (Fig. 3c complementaria). Estos resultados demuestran que, aunque el VACV∆E5R tiene una capacidad de replicación similar a la del WT VACV in vitro, se atenúa in vivo, probablemente debido a las respuestas inmunitarias innatas del huésped inducidas por la infección del VACV∆E5R. Los títulos virales reducidos en varios tejidos después de la infección por VACV∆E5R se correlacionan con una menor pérdida de peso y una mejor supervivencia de los animales infectados (Fig. 2a, b). Estos resultados indican que VACV∆E5R está atenuado en comparación con WT VACV y, por lo tanto, demuestran que E5 es un factor de virulencia. Además, VACV∆E5R (2 × 107 pfu) ganó virulencia en ratones cGas-/-, o Stinggt/gt, pero permaneció atenuado en ratones Mda5-/-, lo que indica que la vía de detección de ADN citosólico mediada por cGAS o STING es indispensable para el huésped. defensa contra la infección intranasal con VACV∆E5R (Fig. 2c, d). Además, detectamos IFN-β en el lavado broncoalveolar (BALF) 48 h después de la infección por VACV∆E5R (Fig. 2e), lo que indica que la infección intranasal con infección por VACV∆E5R podría inducir la producción de IFN-β in vivo.

a, b Porcentajes de peso inicial (a) y curvas de supervivencia de Kaplan-Meier (b) de ratones WT C57BL/6J (n = 5 en cada grupo) durante los días posteriores a la infección intranasal con WT VACV o VACV∆E5R a una dosis de 2 × 106 pfu por ratón. c, d Porcentajes de peso inicial (c) y curvas de supervivencia de Kaplan-Meier (d) de ratones WT, Mda5-/-, cGas-/- o Stinggt/gt (n = 5 en cada grupo) durante los días posteriores a la administración intranasal infección con VACV∆E5R a una dosis de 2 × 107 pfu por ratón. e Análisis ELISA de los niveles de IFN-β en el BALF recolectado de ratones WT a las 48 h posteriores a la infección con WT VACV o VACV∆E5R a una dosis de 2 × 107 pfu por ratón. n = 5 muestras independientes. f Diagrama esquemático del revertente de longitud completa de VACV E5R y varios mutantes de truncamiento de VACV E5R. g Análisis de RT-qPCR de los niveles de Ifnb en BMDC WT infectados con diferentes virus vaccinia, incluidos VACV, VACV∆E5R, VACV-E5R-FL revertant y varios mutantes de truncamiento de VACV E5R a una MOI de 10 durante 6 h. n = 3 muestras independientes. h, i Porcentajes de peso inicial (h) y curvas de supervivencia de Kaplan-Meier (i) de ratones WT C57BL/6J (n = 5 en cada grupo) durante los días posteriores a la infección intranasal con VACV∆E5R, VACV-E5R de longitud completa revertant, y varios mutantes de truncamiento E5R una dosis de 2 × 107 pfu por ratón. Se utilizó la prueba t de Student no pareada de dos colas para las comparaciones de dos grupos en los estudios. Los datos se presentan como media ± SEM. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para determinar qué dominio (s) de E5 se requieren para la inhibición mediada por E5 de la inducción y virulencia de IFNB, construimos VACV-E5R (longitud completa; FL) y una serie de sus mutantes de truncamiento (Fig. 2f). Los BMDC se infectaron con WT VACV, VACV∆E5R, VACV-E5R-FL y los mutantes de truncamiento E5R. La expresión de Vaccinia C7 se determinó mediante análisis de transferencia Western para verificar la infección viral (Fig. 3d complementaria). Se utilizó PCR cuantitativa en tiempo real para determinar la expresión del gen Ifnb1 en BMDC infectados. Mientras que VACV-E5R (longitud completa) solo indujo levemente la expresión del gen Ifnb1 en células BMDC (Fig. 2g), todos los mutantes de truncamiento de E5R indujeron la expresión del gen Ifnb1 a un nivel similar al de VACV∆E5R (Fig. 2g). Además, la infección intranasal de mutantes truncados de VACV-E5R (longitud completa) y E5R (2 × 107 pfu) en ratones C57BL/6J mostró que solo la infección por VACV-E5R (longitud completa) fue letal, mientras que todos los mutantes truncados causaron pérdida de peso transitoria pero 100% de supervivencia, excepto VACV-E5R∆224N (con 80% de supervivencia) (Fig. 2h, i). Estos resultados demostraron que todos los dominios E5, incluido el dominio helicoidal alfa N-terminal y los dos dominios BEN, son necesarios para la represión de la virulencia y la expresión del gen Ifnb.

Para investigar si el gen E5R del genoma de MVA codifica una proteína funcional, generamos MVA∆E5R. La infección por MVA∆E5R de BMDC regulaba al alza la expresión génica de Ifnb1, Ifna, Ccl4 y Ccl5 (Fig. 3a), mientras que la infección por MVA tenía una inducción modesta. La infección por MVA∆E5R de BMDC indujo niveles mucho más altos de secreción de IFN-β que MVA, MVA inactivado por calor (heat-iMVA) o MVA∆E5R inactivado por calor (heat-iMVA∆E5R) (Fig. 3b). La expresión de Vaccinia E3L fue comparable entre MVA y MVA∆E5R (Fig. 3c). La expresión del gen E3L no se detectó en BMDC infectados con MVA inactivado por calor (Heat-iMVA) o MVA∆E5R (Heat-iMVA∆E5R) inactivado por calor como se esperaba. La inducción de IFN-β en BMDC dependía de las dosis virales (Fig. 4a complementaria). La secreción de IFN-α también fue fuertemente inducida por la infección por MVA∆E5R en BMDC (Fig. 3d). Además, MVA∆E5R causó niveles mucho más altos de producción de cGAMP en BMDC que MVA (Fig. 3e), lo que sugiere que E5 se dirige a cGAS.

una RT-qPCR de la expresión génica de Ifnb1, Ifna, Ccl4 y Ccl5 en BMDC WT infectadas con MVA o MVA∆E5R a una MOI de 10 durante 6 h. n = 3 muestras independientes. b Análisis ELISA de los niveles de IFN-β o IFN-α en los sobrenadantes de BMDC WT infectadas con MVA, MVA∆E5R, Heat-iMVA o Heat-iMVA∆E5R a una MOI de 10 durante 16 h. n = 3 muestras independientes. c Análisis RT-qPCR de la expresión del gen E3 en BMDC WT infectados con diferentes virus vaccinia a una MOI de 10 durante 16 h. n = 3 muestras independientes. d Análisis ELISA de los niveles de IFN-α en los sobrenadantes de BMDC WT infectados con MVA o MVA∆E5R a una MOI de 10 durante 16 h. n = 3 muestras independientes. e Análisis ELISA de los niveles de cGAMP en BMDC WT infectadas con MVA o MVA∆E5R a una MOI de 10 durante 16 h. n = 3 muestras independientes. f Análisis ELISA de los niveles de IFN-β en el BMDC de ratones WT, cGas-/-, Stinggt/gt, Irf3-/- e Irf7-/- infectados con MVA o MVA∆E5R a una MOI de 10 durante 16 h. n = 3 muestras independientes. *** p < 0,001. Se utilizó la prueba t de Student no pareada de dos colas para las comparaciones de dos grupos en los estudios. Los datos se presentan como media ± SEM. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Similar a BMDC, la infección por MVA∆E5R de macrófagos derivados de la médula ósea (BMM) o fibroblastos dérmicos primarios también indujo niveles mucho más altos de secreción de IFN-β que MVA (Figuras complementarias 4b, c). Estos resultados demostraron que vaccinia E5 bloquea la activación de cGAS y la eliminación de E5R del genoma de MVA activa de forma potente la vía cGAS/STING en múltiples tipos de células mieloides. Además, la secreción de IFN-β inducida por MVA∆E5R de BMDC se eliminó en células cGAS-/- o STINGGt/Gt y disminuyó en células IRF3-/- o IRF7-/- (Fig. 3f). Además de los BMDC, la secreción de IFN-β inducida por MVA∆E5R en BMM o fibroblastos primarios también dependía de la vía cGAS/STING (Figuras complementarias 4b, c). Estos resultados demuestran que la vía de detección de ADN citosólico mediada por cGAS/STING y el factor de transcripción IRF3 e IRF7 son necesarios para la secreción de IFN-β inducida por MVA∆E5R en varios tipos de células primarias.

Además del ADN viral parental proporcionado por los viriones entrantes, el ADN viral de la progenie generado después de la replicación del ADN en los virosomas también puede estimular el sensor de ADN citosólico cGAS, lo que resulta en la producción de IFN-β. Para evaluar esto, usamos fosfonoacetato (PAA) o afidicolina para bloquear la replicación del ADN viral38,39. El tratamiento con PAA o afidicolina de MEF infectados con MVA∆E5R bloqueó la formación de virosomas como se esperaba (Fig. 4d complementaria) y eliminó las expresiones de genes virales tardíos como A27 y A34 (Fig. 4e complementaria). Las expresiones génicas de Ifnb1 e Ifna inducidas por MVA∆E5R se redujeron parcialmente en presencia de PAA o afidicolina (Fig. 2e complementaria). En general, nuestros resultados indican que tanto el ADN viral parental como el de la progenie de las BMDC infectadas con MVA∆E5R contribuyen a la inducción de IFN tipo I.

Para investigar cómo E5 antagoniza la vía cGAS/STING, primero evaluamos los niveles de proteína cGAS después de la infección por VACV WT. Observamos que los niveles de proteína cGAS fueron más bajos seis horas después de la infección por VACV WT en BMDC en comparación con el control de infección simulada (Fig. 4a), lo que sugiere que la proteína cGAS podría degradarse después de la infección viral. El tratamiento con el inhibidor del proteasoma MG132 evitó la degradación de cGAS, mientras que el tratamiento con un inhibidor de pan-caspasa, Z-VAD o un inhibidor VIII de AKT1/2 tuvo poco efecto sobre los niveles de cGAS (Fig. 4a). El tratamiento con el inhibidor de la traducción de proteínas cicloheximida (CHX) bloqueó parcialmente la degradación de cGAS, lo que sugiere que las proteínas virales recién sintetizadas podrían facilitar la degradación de cGAS (Fig. 4a). Se utilizó el nivel de proteína C7 de Vaccinia en células infectadas para verificar la infección y los efectos del fármaco. Por ejemplo, la proteína C7 estaba ausente en las células infectadas con WT VACV en presencia de CHX (Fig. 4a). Estos resultados indican que la degradación de cGAS inducida por WT VACV depende del proteasoma. A diferencia de WT VACV, la infección de BMDC con VACV∆E5R no resultó en la degradación de cGAS (Fig. 4b). De manera similar, mientras que la infección por MVA de BMDC desencadenó la degradación de cGAS, la infección por MVA∆E5R no lo hizo (Fig. 4c), lo que confirma que E5 contribuye a la degradación de cGAS en el contexto de la infección por VACV o MVA.

una inmunotransferencia de cGAS en MEF infectados con WT VACV a una MOI de 10 durante 6 h. Las células se pretrataron con cicloheximida (CHX, 25 µg/mL), inhibidor de proteasoma MG132 (25 µM), inhibidor de pan-caspasa Z-VAD (50 µM), inhibidor de AKT1/2 VIII (10 µM) durante 30 min y luego se infectaron con WT VACV en presencia de cada fármaco individual. Las células se recogieron a las 6 h después de la infección. b, c Inmunotransferencia de cGAS en BMDC infectadas con el virus indicado a una MOI de 10. Las células se pretrataron con o sin MG132 (25 µM) durante 30 min antes de infectarse con el virus. Las células se recogieron en el momento indicado después de la infección. d Los BMDC se infectaron con MVA a una MOI de 10. En los puntos de tiempo indicados, se recogieron las células y las perlas Halo-4xUBAUBQLN1 derribaron las proteínas ubiquitinadas totales. El anticuerpo anti-cGAS detectó cGAS ubiquitinado. mUB-cGAS cGAS monoubiquitinado, Poly-UB-cGAS cGAS poliubiquitinado, PD desplegable. Las células HEK293T se cotransfectaron con plásmidos que expresan V5–cGAS y HA-Ub (solo WT o K48). Veinticuatro horas más tarde, las células se infectaron con MVA o MVAΔE5R a una MOI de 10 durante 6 h en presencia de MG132 (25 µM). El cGAS fue derribado por un anticuerpo anti-V5 y el cGAS ubiquitinado fue determinado por un anticuerpo anti-HA. Inmunoprecipitación IP. Lisados ​​de células completas de WCL. f Imágenes confocales representativas que muestran la ubicación de E5-Flag en BMDC después de la infección por MVAΔE5R-E5-Flag o MVAΔE5R-E5R95K-Flag en un MOI 10 durante 6 h. E5-Flag se tiñó con un anticuerpo anti-Flag. Barra de escala, 50 μm. g Inmunotransferencia de E5-Flag en extractos citoplasmáticos y nucleares de BMDC infectadas con MVAΔE5R-E5-Flag o MVAΔE5R-E5R95K-Flag a una MOI de 10 durante 6 h. Extracto citoplasmático CE, extracto nuclear NE. h Análisis ELISA de los niveles de IFN-β en sobrenadantes de BMDC infectados con MVA, MVA∆E5R, MVAΔE5R-E5-Flag o MVAΔE5R-E5R95K-Flag a una MOI de 10 durante 16 h. n = 3 muestras independientes. Se utilizó la prueba t de Student no pareada de dos colas para las comparaciones de dos grupos en los estudios. Los datos son representativos de dos (f) o tres (a–e) experimentos independientes y se presentan como media ± SEM. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para probar si la infección por MVA de BMDC desencadena la ubiquitinación de cGAS endógeno, se infectaron BMDC con MVA a una MOI de 10 en presencia de MG132 durante los tiempos indicados. Las proteínas ubiquitinadas totales de BMDC infectadas con MVA se enriquecieron con cuentas Halo-4×UBAUBQLN1, que contienen cuatro dominios asociados a ubiquitina (UBA) en tándem de Ubiquilin-1 para extraer específicamente las proteínas ubiquitinadas40. Tanto las bandas de cGAS monoubiquitinadas como las poliubiquitinadas se detectaron tan pronto como 2 h después de la infección y aumentaron a las 4 y 6 h después de la infección (Fig. 4d). Este patrón de ubiquitinación se correlacionó con la cinética de degradación de cGAS. También detectamos cGAS sin modificar en todas las muestras, lo que probablemente se deba a la unión no específica de cGAS sin modificar a las perlas y/o la formación de complejos de oligómeros con cGAS ubiquitinado.

Presumimos que vaccinia E5 podría inducir la ubiquitinación de cGAS y la subsiguiente degradación dependiente del proteasoma. Para comprobarlo, se cotransfectaron células HEK293T con plásmidos que expresan V5–cGAS y HA-Ub (solo WT o K48). Veinticuatro horas más tarde, las células se infectaron con MVA o MVAΔE5R en presencia de MG132. El cGAS fue derribado por un anticuerpo anti-V5 y el cGAS ubiquitinado fue determinado por un anticuerpo anti-HA. Detectamos niveles más altos de ubiquitinación de cGAS, particularmente poliubiquitinación ligada a K48, en células infectadas con MVA en comparación con las infectadas con MVA∆E5R (Fig. 4e). Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que E5 expresado por MVA promueve la poliubiquitinación de cGAS ligada a K48 que conduce a su degradación.

Para visualizar la expresión de E5, generamos un virus recombinante MVA∆E5R-E5-Flag. Las imágenes confocales de BMDC infectadas con MVA∆E5R-E5-Flag mostraron la localización citoplásmica y del núcleo de E5 (Fig. 4f). El análisis de transferencia Western confirmó que E5 se expresó tanto en el citoplasma como en el núcleo (Fig. 4g). Se usó GAPDH como control positivo para la proteína citoplasmática y se usó Lamin B1 como control positivo para la proteína del núcleo. Además, la infección con MVA∆E5R-E5-Flag de BMDC dio como resultado una producción de IFN-β mucho menor que MVA∆E5R (Fig. 4h), lo que indica que el etiquetado de E5 con Flag en el extremo C de la proteína retuvo su función inhibidora en la vía cGAS/STING. En el proceso de generación del virus MVA∆E5R-E5-Flag mediante la selección de fármacos, aislamos una cepa mutante, MVA∆E5R-E5R95K-Flag, que contiene un solo cambio de nucleótido (G284A), lo que da como resultado el reemplazo de la arginina en el amino ácido 95 de E5 por lisina. E5R95K-Flag se expresó en el citoplasma pero no en el núcleo de los BMDC infectados con MVA∆E5R-E5R95K-Flag (Fig. 4f). La transferencia Western confirmó que solo se detectó la proteína E5R95K-Flag citoplásmica pero no la del núcleo después de la infección por MVA∆E5R-E5R95K-Flag en BMDC (Fig. 4g). Además, la producción de IFN-β disminuyó en los BMDC infectados con MVA∆E5R-E5R95K-Flag (Fig. 4h), que fue similar a la producida por los BMDC infectados con MVA∆E5R-E5-FLAG, lo que indica que el E5 citoplasmático es suficiente para suprimir la producción de IFN tipo I.

Para probar si E5 solo puede desencadenar la degradación de cGAS sin infección viral, cotransfectamos un plásmido que expresa cGAS con un plásmido que expresa E5R o un vector vacío en células HEK293T. 24 h más tarde, las células se infectaron con MVAΔE5R a una MOI de 10 durante 6 h. Observamos que el nivel de cGAS disminuyó después de la cotransfección con el plásmido que expresa E5R pero no con el vector vacío (Fig. 5a). Además, la infección por MVA∆E5R no mejoró la degradación de cGAS mediada por E5 (Fig. 5a), lo que indica que E5 solo puede desencadenar la degradación de cGAS, probablemente en el contexto de la transfección de plásmidos. A continuación, probamos si la sobreexpresión de E5 a través de la transducción lentiviral en MEF también resultó en la degradación de cGAS. Los MEF se transdujeron con un vector lentiviral que expresa mcherry o E5-Flag. Cuarenta y ocho horas más tarde, se recogieron lisados ​​celulares y se determinó la expresión de cGAS. Observamos que la sobreexpresión de E5-Flag también redujo los niveles endógenos de cGAS en MEF (Fig. 5b).

Se cotransfectaron células HEK293T con plásmidos V5–cGAS y pcDNA-E5R-Flag o pcDNA3.1. Veinticuatro horas más tarde, las células se infectaron con MVAΔE5R a una MOI de 10 durante 6 h. Los niveles de proteína V5-cGAS se determinaron mediante un anticuerpo anti-V5. Se midió la proteína C7 para indicar infección por MVAΔE5R. b Las células MEF se infectaron con retrovirus que expresan E5R-Flag o mcherry. Cuarenta y ocho horas después, se determinaron los niveles de proteína cGAS mediante un anticuerpo anti-cGAS. c Las células HEK293T se transfectaron con plásmidos V5–cGAS y pcDNA-E5R-Flag o pcDNA3.1. Veinticuatro horas más tarde, los lisados ​​celulares se trataron con o sin Benzonase (250 U/mL). V5–cGAS fue derribado por un anticuerpo anti-V5, y E5-Flag fue determinado por un anticuerpo anti-Flag. d BMDC de ratones WT o cGas-/- se infectaron con MVAΔE5R-E5R-Flag a una MOI de 10 durante 6 h. Los lisados ​​celulares se trataron con o sin benzonasa (250 U/ml). cGAS fue derribado por un anticuerpo anti-cGAS, y E5-Flag fue determinado por un anticuerpo anti-Flag. e Imágenes confocales representativas que muestran ubicaciones de E5-Flag y cGAS en BMDC después de la infección por MVAΔE5R-E5-Flag en un MOI 10 durante 6 h. E5-Flag se tiñó con un anticuerpo anti-Flag. El cGAS endógeno se tiñó con un anticuerpo anti-cGAS. Barra de escala, 15 μm. f Las células HEK293T se transfectaron con plásmidos V5–cGAS y pcDNA-E5R-Flag o pcDNA3.1. Veinticuatro horas más tarde, las células se recolectaron después de tratarlas con MG132 (25 µM) durante 6 h, y las proteínas ubiquitinadas totales se derribaron con perlas Halo-4xUBAUBQLN1. El anticuerpo anti-cGAS detectó cGAS ubiquitinado. mUB-cGAS cGAS monoubiquitinado, Poly-UB-cGAS cGAS poliubiquitinado, PD desplegable. g El modelo de trabajo de vaccinia E5 antagoniza cGAS citoplasmático. Los datos son representativos de dos (e) o tres (a–d) experimentos independientes y se presentan como media ± SEM. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para evaluar si E5 y cGAS interactúan entre sí, transfectamos células HEK293T con plásmido de expresión V5–cGAS y E5-Flag. La inmunoprecipitación con anticuerpo anti-V5 eliminó E5-Flag, lo que indica una interacción E5-cGAS (Fig. 5c). Para probar si se requiere ADN para mediar en la interacción de E5 y cGAS, los lisados ​​celulares se trataron con o sin Benzonase, una endonucleasa que elimina tanto el ADN como el ARN. El tratamiento con benzonasa no logró interrumpir la interacción E5-cGAS, lo que indica que dicha interacción no está mediada por el ADN (Fig. 5c). A continuación, probamos si E5-Flag expresado por MVA∆E5R-E5-Flag interactuaba con cGAS endógeno en BMDC. Brevemente, los BMDC WT y cGAS-/- se infectaron con MVA∆E5R-E5-Flag a una MOI de 10 durante 6 h. Los lisados ​​celulares se trataron con o sin benzonasa. cGAS fue derribado por un anticuerpo anti-cGAS, y E5-Flag fue determinado por un anticuerpo anti-Flag. El ensayo de co-inmunoprecipitación mostró que en BMDC WT, cGAS interactuó con E5-Flag, y el tratamiento con Benzonase no logró interrumpir la interacción (Fig. 5d). No pudimos detectar tal interacción en cGAS-/- BMDC. También visualizamos la colocalización de E5-Flag y cGAS endógeno en BMDC infectados con MVA∆E5R-E5-Flag (Fig. 5e). Además, la cotransfección de plásmidos que expresan cGAS y E5R en células HEK293T promovió una ubiquitinación de cGAS más fuerte que cGAS solo (Fig. 5f). En conjunto, mediante el uso de métodos de transfección de plásmidos, transducción lentiviral y MVA∆E5R–E5-Flag en varios tipos de células de mamíferos, incluidos HEK293T, MEF y BMDC, demostramos interacciones entre E5 y cGAS, que son independientes de la unión al ADN. Nuestros resultados también demuestran que E5 mejora la ubiquitinación de cGAS y la posterior degradación a través de un mecanismo dependiente de proteasoma (Fig. 5g).

MVA se ha investigado como vector de vacunas para diversas enfermedades infecciosas10, como el VIH, la tuberculosis, la malaria, el ébola y el SARS-CoV-2, y la infección por MVA activa modestamente las DC derivadas de monocitos humanos (moDC)41. Para investigar si la eliminación de E5R mejora la inmunogenicidad del vector viral, primero generamos MVA∆E5R-OVA, expresando un antígeno modelo de ovoalbúmina de pollo (OVA) y luego comparamos la maduración de DC tras la infección con MVA∆E5R-OVA frente a MVA-OVA. Observamos que la infección por MVA∆E5R-OVA indujo niveles más altos de expresión de CD86 y CD40 en comparación con MVA-OVA a las 24 h posteriores a la infección (Fig. 6a-c). Sin embargo, la expresión de CD86 y CD40 inducida por MVA∆E5R-OVA y MVA-OVA disminuyó en cGAS-/- BMDC, lo que indica que la vía de detección de ADN citosólico es esencial para la maduración de DC inducida por MVA∆E5R-OVA o MVA-OVA (Fig. 6a-c).

a–c Gráficos de puntos de citometría de flujo representativos (a, b) o análisis (c) de la expresión de CD86 y CD40 en WT o cGas-/- BMDC infectados con MVA-OVA o MVAΔE5R-OVA en MOI 10 durante 16 h. n = 3 muestras independientes. d Mapa de calor que muestra la expresión relativa de genes relacionados con el sistema inmunitario seleccionados en infección por BMDC WT o cGas-/- con MVA o MVA∆E5R. Estos incluyen genes involucrados en la presentación de antígenos, activación de DC, IFN y citocinas y quimiocinas proinflamatorias, y sensores inmunitarios innatos. e Respuestas de células T específicas de antígeno después de la vacunación con MVA-OVA o MVA∆E5R-OVA. Se vacunaron ratones C57BL/6J con MVA-OVA o MVAΔE5R-OVA mediante escarificación de la piel (SS) o inyección intradérmica (ID). Una semana más tarde, se recolectaron bazos y ganglios linfáticos de drenaje (dLN), y se determinaron mediante FACS células T CD8+ específicas de SIINFEKL en esplenocitos y células T CD8+ específicas de tetrámero OVA o Th1 CD4+ en ganglios linfáticos. n = 5 muestras independientes. Se utilizó la prueba t de Student no pareada de dos colas para las comparaciones de dos grupos en los estudios. Los datos se presentan como media ± SEM. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

El análisis de RNA-seq de WT o cGAS-/- BMDC infectados o simulados con MVA o MVA∆E5R demostró que la infección por MVA∆E5R en WT BMDC indujo niveles más altos de IFN tipo I y genes de citocinas y quimiocinas proinflamatorias, incluidos Ifnb1, Ccl5, Ccl12, Il12b, Il6, Il27, marcadores de activación y maduración de DC como CD86, CD40 y CD69, así como genes implicados en la presentación cruzada de antígenos, incluidos Tap1, H2-Q4, H2-Q6 y H2 -Q7, en comparación con MVA (Fig. 6d y Fig. Suplementaria 5a, b). La regulación positiva de estos genes tanto por MVA como por MVA∆E5R dependía de cGAS (Fig. 6d y Fig. 5a, c complementarias).

A continuación, realizamos la vacunación mediante SS o inyección intradérmica (ID) con MVA-OVA o MVA∆E5R-OVA. Una semana después de la vacunación, se analizaron las células T anti-OVA CD8+ y Th1 CD4+ en los bazos y los ganglios linfáticos de drenaje. La vacunación con MVA∆E5R-OVA dio como resultado más células T CD8+ específicas de OVA en los bazos que MVA-OVA (Fig. 6e). Y se detectaron más células T CD8+ o Th1 CD4+ específicas de OVA en los ganglios linfáticos de drenaje (dLN) después de la vacunación con MVA∆E5R-OVA, en comparación con MVA-OVA (Fig. 6e). Estos resultados proporcionan evidencia de que la eliminación del gen E5R de MVA aumenta las respuestas de células T específicas de antígeno después de las vacunas.

La identificación de vaccinia E5 como un inhibidor principal del sensor de ADN citosólico cGAS destaca la importancia de esa vía en la defensa del huésped contra la infección por poxvirus. E5, un miembro fundador de la familia del dominio BEN, se conserva entre los ortopoxvirus. Aquí mostramos que el factor de virulencia E5 se une a cGAS, desencadenando la ubiquitinación de cGAS y la degradación dependiente del proteasoma y que la eliminación de E5R del vector viral MVA mejora su inmunogenicidad.

Los poxvirus virulentos, incluidos el VVAC (cepas WR y Copenhague), la viruela bovina y el virus de la ectromelia, no activan STING, a diferencia del derivado altamente atenuado, MVA42,43. Además, la infección por MVA pero no por WT VACV de BMDC induce la producción de cGAMP, lo que sugiere que VACV codifica uno o más inhibidores de cGAS. A través de una selección imparcial de 80 genes de vaccinia, identificamos varios genes candidatos que podrían codificar inhibidores de cGAS, incluidos E5R, K7R, C11R, WR199/B18R y WR200/B19R. Luego nos enfocamos en E5R porque un mutante de VACV que carecía de E5R inducía una cantidad moderada de secreción de IFN-β y producción de cGAMP en BMDC, mientras que los mutantes de VACV que carecían de otros genes candidatos individuales (incluidos B2R, E3L, C11R, WR199, WR200, K7R y C7L ) no pudo inducir la secreción de IFN-β en BMDC. En nuestras condiciones, el VVAC que carece del gen B2R, que codifica una nucleasa cGAMP, no logra inducir la producción de IFN tipo I en BMDC, lo que sugiere que podría haber una(s) proteína(s) viral(es) vacuna(s) adicional(es) que antagonice(n) la vía cGAS/STING.

A diferencia del VVAC de tipo salvaje, la infección por MVA de células dendríticas derivadas de la médula ósea induce IFN tipo I de manera dependiente de cGAS/STING43. Nuestro estudio mostró que E5 en MVA sigue siendo funcional porque la eliminación del gen E5R de MVA mejora drásticamente la inducción de IFN tipo I en BMDC, BMM y fibroblastos primarios. Por otro lado, la presencia de E5 en MVA no logra bloquear por completo la producción de IFN, lo que podría atribuirse a la falta de WR200/B19R (IFNAR), B2R u otros inhibidores potenciales funcionales15. Estudios anteriores han demostrado que múltiples proteínas virales de vaccinia se dirigen a la inducción de IFN de tipo I impulsada por ADN, como B2, C4, C16, F17, N2 y C619,44,45,46,47,48,49. Específicamente, C4 y C16 se dirigen a otro sensor de ADN, DNA-PK, que desempeña un papel en la activación de IRF3 en fibroblastos44,45,50, y ambos mutan o se pierden en MVA15.

Aunque E5 se identificó por primera vez mediante espectrometría de masas como una de las tres principales proteínas virales tempranas asociadas con virosomas en células infectadas con vaccinia33, la función de E5 seguía siendo esquiva. E5 también se encontró en los viriones altamente purificados por espectrometría de masas después de la reticulación química, y se identificaron varios socios de interacción, incluidas las subunidades de ARN polimerasa RAP94, RP147 y NTP151. Aquí mostramos la presencia de E5 tanto en el núcleo como en el citoplasma de las células infectadas. En células infectadas con MVA∆E5R-E5R95K-Flag, E5R95K se localiza solo en el citoplasma pero es suficiente para mediar la inhibición de IFN. La mutación R95K está dentro de una supuesta señal de localización nuclear de E5, 92KFKRMIR98.

Mostramos que E5 media la degradación de cGAS a través de una vía dependiente de proteasoma. Proponemos el siguiente modelo de trabajo basado en nuestros resultados (Fig. 5g). El virus vaccinia ingresa a las células huésped a través de la macropinocitosis52. Tras la entrada viral, el ADN viral es detectado por el sensor de ADN citosólico cGAS, cuya activación conduce a la producción de cGAMP y la posterior estimulación de STING. Sin embargo, en presencia de vaccinia E5, que es sintetizada principalmente por los viriones entrantes como una proteína viral temprana, cGAS es objeto de ubiquitinación y degradación dependiente del proteasoma a través de la interacción con E5. Esto conduce a una reducción de la producción de cGAMP y de la expresión del gen Ifnb1. Es posible que E5 pueda ser el objetivo de proteínas huésped como los ISG. No pudimos mostrar una interacción directa entre cGAS y E5 debido a la incapacidad de generar proteína E5 recombinante a pesar de muchos intentos en diferentes sistemas de expresión de proteínas, incluidos los sistemas de expresión bacterianos que usan Escherichia coli, los sistemas de expresión de células de insectos que usan Sf9 y la expresión de células de mamíferos. sistemas que utilizan ovario de hámster chino. Aunque pudimos mostrar la interacción de E5 y cGAS mediante coinmunoprecipitación en varios sistemas experimentales, que no se interrumpió con el tratamiento con benzonasa, no podemos concluir que cGAS y E5 tengan una interacción directa en este estudio. Además, observamos que algunos de los E5 recién expresados ​​se trasladan al núcleo. Se ha informado que el cGAS nuclear es inhibido por los nucleosomas53,54. Las funciones exactas del E5 nuclear necesitan más investigación.

Anteriormente informamos que la replicación viral no es importante para la detección de MVA en BMDC43. En este estudio, sin embargo, la expresión del gen Ifnb1 inducida por MVA∆E5R se redujo parcialmente en presencia de los inhibidores de la replicación del ADN viral, PAA y afidicolina. Este resultado sugiere que cGAS detecta el ADN de la progenie virosómica en el contexto de la infección por MVA∆E5R. Suponemos que en presencia de E5 durante la infección por MVA, el ADN de la progenie virosómica podría estar protegido de la detección de cGAS.

Se han informado varias modificaciones postraduccionales de cGAS, que incluyen ubiquitinación, fosforilación, acetilación, sumoilación, ISGilación, glutamilación, neddilación y escisión mediada por caspasa55,56. Por ejemplo, se ha demostrado que RNF185, una ligasa de ubiquitina E3 del dominio RING, interactúa con cGAS durante la infección por el virus simple humano 1 (HSV-1), estimulando la poliubiquitinación de cGAS ligada a K27, importante para la actividad enzimática de cGAS57. TRIM56, una ubiquitina ligasa E3 inducible por IFN, interactúa con cGAS para promover la monoubiquitinación y la producción de cGAMP58. Además, TRIM14, una proteína inducible por IFN, recluta USP14 para escindir las cadenas de poliubiquitina unidas a K48 de cGAS y, por lo tanto, inhibe la degradación de cGAS a través de la autofagia59. La ubiquitina E3 ligasa responsable de la poliubiquitinación ligada a K48 de cGAS sigue siendo esquiva59. Aquí mostramos que la infección por MVA induce la monoubiquitinación y la poliubiquitinación de cGAS y promueve su degradación de manera dependiente del proteasoma. E5 es fundamental para este proceso al interactuar con cGAS. Sin embargo, los detalles exactos de cómo E5 recluta una ligasa de ubiquitina E3 viral o celular para catalizar la ubiquitinación de cGAS aún no se han determinado.

El descubrimiento de E5 como inhibidor principal de cGAS proporciona información importante para mejorar MVA como vector de vacuna. Aquí mostramos que la infección por MVA∆E5R-OVA de BMDC induce altos niveles de producción de IFN-β y maduración de DC, de acuerdo con los cambios transcriptómicos dependientes de cGAS inducidos por MVA∆E5R. La vacunación con MVA∆E5R-OVA induce niveles más altos de células T CD8+ y Th1 CD4+ específicas de OVA en comparación con MVA-OVA. Estudios recientes han demostrado que los vectores de vacunas basados ​​en MVA que expresan la proteína de pico del SARS-CoV-2 inducen potentes respuestas inmunitarias de células T y B contra el pico y brindan protección en ratones, hámsteres y macacos contra la infección por SARS-CoV-2 y la inmunopatología pulmonar60, 61,62,63,64. Se justifica la investigación futura de si los vectores de vacunas basados ​​en MVA∆E5R mejoran la eficacia de la vacuna contra agentes infecciosos como el SARS-CoV-2.

Entre todos los candidatos a inhibidores de cGAS codificados por vaccinia identificados en este estudio, E5, K7, C11, WR199/B18 y WR200/B19, y B2 (poxina) informado previamente, solo la infección por VACV∆E5R de BMDC indujo niveles significativos de tipo IFN (Fig. 1d). Dado que la activación de la vía cGAS/STING en las CD es fundamental para la terapia viral oncolítica inducida por virus65, la eliminación de E5R y quizás otros inhibidores de esta vía de la vacuna oncolítica mejoraría su seguridad y potencial terapéutico.

Nuestra investigación cumple con todas las normas éticas pertinentes. Realizamos todos los procedimientos en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio del Instituto Nacional de Salud, y el protocolo (#19-01-002) fue aprobado por el Centro de Cáncer Memorial Sloan Kettering (MSKCC ) Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC). Todos los ratones se alojaron en las instalaciones para animales libres de patógenos específicos del MSKCC en las siguientes condiciones: temperaturas de 21,1 a 22,2 °C (70 a 72 °F), 30 a 70 % de humedad y un ciclo de luz/oscuridad de 12:12 h (las luces estaban encendidas de 6 am a 6 pm). Los ratones fueron sacrificados al final del experimento con asfixia con CO2, con dislocación cervical como método de seguridad secundaria física.

Se compraron ratones C57BL/6J de entre 6 y 8 semanas de edad en Jackson Laboratory y se usaron para la preparación de células dendríticas derivadas de médula ósea (BMDC) y para experimentos de infección intranasal. Los ratones cGas-/- se adquirieron en Jackson Laboratory. Los ratones Stinggt/gt se generaron en el laboratorio de Russell Vance (Universidad de California, Berkeley)66. Se generaron ratones Mda5-/- en el laboratorio de Marco Colonna (Universidad de Washington)67. Los ratones Irf3-/- fueron proporcionados por Ruslan Medzhitov (Universidad de Yale). Los ratones Irf7-/- fueron generados por Shizuo Akira (Universidad de Osaka). Todos los ratones transgénicos son de fondo C57BJ/6J.

Se propagó la cepa WR del virus vaccinia (VACV) (ATCC VR-1354) y se determinaron los títulos de virus en monocapas de BSC40 (células de riñón de mono verde africano) a 37 °C. MVA fue proporcionado amablemente por Gerd Sutter (Universidad de Munich) y propagado en células BHK-21 (células de riñón de hámster bebé, ATCC CCL-10). MVA-OVA fue un amable regalo del Dr. Ingo Drexler (Universidad Heinrich Heine de Düsseldorf). El VACV∆E3L fue proporcionado amablemente por BL Jacobs (Universidad Estatal de Arizona). El virus VACV∆C11R fue proporcionado amablemente por Bernard Moss (Institutos Nacionales de Salud)68. Todos los virus se purificaron a través de un colchón de sacarosa al 36%. Heat-iMVA o Heat-iMVA∆E5R se generó incubando el virus MVA o MVA∆E5R purificado a 55 °C durante 1 hora. Para generar el virus VACV∆E5R recombinante, se infectaron células BSC40 con virus vaccinia WT (WR) a una MOI de 0,2. Después de 1 a 2 h, las células se transfectaron con plásmidos pE5R-mCherry con Lipofectamine 2000 (Invitrogen). La recombinación homóloga entre el ADN del plásmido y el genoma viral de vaccinia resultó en la eliminación del gen E5R del genoma viral y la inserción de mCherry, bajo el control del promotor temprano y tardío sintético de vaccinia (pSE/L). Las células se recogieron 2 días después y se sometieron a tres ciclos de congelación-descongelación. La purificación de la placa se realizó en base a la fluorescencia de mCherry vista bajo el microscopio. Después de 4-5 rondas, se obtuvieron virus VACV∆E5R-mCherry recombinantes puros y se confirmó la validación de la eliminación de E5R mediante análisis de PCR y secuenciación de ADN. Varios otros mutantes de deleción, incluidos VACV∆WR199, VACV∆K7R, VACV∆C7L que expresan mcherry, VACV∆B2R y VACV∆WR200 que expresan GFP, se generaron siguiendo un procedimiento similar al descrito anteriormente. VACV-E5R-FL, VACV-E5R∆59N, VACV-E5R∆106N, VACV-E5R∆224N, VACV-E5R∆117C y VACV-E5R∆235C se generaron insertando E5R completo o truncado en el locus E5R de VACV∆E5R. MVA∆E5R y MVA∆E5R-OVA que expresan mCherry se generaron mediante recombinación homóloga en los loci E4L y E6R que flanquean el gen E5R del genoma MVA o MVA-OVA en células BHK21 siguiendo un procedimiento similar al descrito anteriormente. MVA∆E5R–E5-Flag se generó insertando la secuencia E5R-Flag en el locus TK de MVA∆E5R. MVA∆E5R-E5R95K-Flag se generó mediante la inserción de la secuencia E5R-Flag en el locus TK de MVA∆E5R utilizando la selección de fármacos. El virus recombinante se enriqueció en presencia de medio de selección de gpt, que incluía MPA, xantina e hipoxantina, y la placa se purificó durante al menos cuatro rondas. Durante el proceso de selección, se produjo una mutación espontánea, lo que resultó en la generación de MVA∆E5R-E5R95K-Flag, verificado por PCR y secuenciación de ADN. Los virus vaccinia recombinantes se verificaron mediante PCR de ADN viral genómico (Fig. 7 complementaria).

Se anestesiaron ratones C57BL/6J hembra de entre 6 y 8 semanas de edad (5–10 en cada grupo) y se infectaron por vía intranasal con WT VACV, VACV∆E5R o VACV∆E5 que expresan E5R de longitud completa revertida y varios mutantes truncados de E5R en el punto indicado. dosis en 20 µl de PBS. Los ratones fueron monitoreados y pesados ​​diariamente. Los que perdieron más del 30% de su peso inicial fueron sacrificados. Se determinaron las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier. El líquido de lavado broncoalveolar (BALF) se recogió después de la infusión intratraqueal de 1 ml de PBS frío. Para medir los títulos virales dentro de diferentes órganos, se recolectaron pulmones, hígados y bazos, se colocaron en tubos con 1 ml de PBS y se homogeneizaron con el disociador Miltenyi GentleMACS. Las suspensiones de células se sometieron a ciclos de congelación y descongelación tres veces y se sonicaron antes de la titulación en células BSC40. La sangre se recogió en tubos Eppendorf de 1,5 ml y el suero se guardó después de la centrifugación. Los títulos de virus se determinaron calculando el número de placas (pfu) por gramo de tejido (pfu/g).

BSC40 se infectó con WT VACV o VACV∆E5R a una MOI de 0,05. A continuación, las células se rasparon en el medio y se recogieron en los tiempos indicados. Después de tres ciclos de congelación-descongelación y posterior sonicación, se determinaron los títulos virales en las muestras recolectadas mediante ensayo de placas en células BSC40.

Se vacunaron ratones hembra C57BL/6J de 6 a 8 semanas de edad mediante inyección SS o ID con MVA-OVA o MVA∆E5R-OVA a una dosis de 2 × 107 pfu. Una semana más tarde, los bazos y los ganglios linfáticos de drenaje (dLN) se recolectaron y procesaron con el disociador Miltenyi GentleMACS™. Los esplenocitos se estimularon con el péptido OVA257–264 (SIINFEKL) (5 μg/mL). Después de 1 h de estimulación, se añadió GolgiPlug (BD Biosciences) (dilución 1:1000) y se incubó durante 12 h. A continuación, las células se trataron con el kit BD Cytofix/Cytoperm™ antes de la tinción con los anticuerpos respectivos para los análisis de citometría de flujo. Los anticuerpos utilizados para este ensayo son los siguientes: BioLegend: CD3e (145-2C11), CD4 (GK1.5), CD8 (53-5.8), IFN-γ (XMG1.2).

Las dLN se digirieron con colagenasa D (2,5 mg/ml) y ADNasa (50 µg/ml) a 37 °C durante 25 min antes de filtrarlas a través de un filtro celular de 70 µm. Para la tinción de tetrámeros, las células se incubaron con tetrámeros durante 30 min a 37 °C. El tetrámero Alexa Fluor 647 H-2K(b) ova 257-264 SIINFEKL y el tetrámero PE IA(b) Ova 329-337 AAHAEINEA se sintetizaron a partir de NIH Tetramer Core Facility. Las células se analizaron en el BD LSRFortessa.

BSC40, HEK293T y MEF se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (Corning, Cat# 10-014-CV) suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10 %, l-glutamina 2 mM y 100 U/ml de penicilina y 100 μg /ml de estreptomicina. BHK-21 se cultivó en medio esencial mínimo de Eagle (Eagle's MEM, Life Technologies, Cat# 11095-080) que contenía FBS al 10 %, con 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina. Para la generación de GM-CSF-BMDC, se cultivaron células de médula ósea (5 millones de células en cada placa de cultivo celular de 15 cm) en medio RPMI-1640 suplementado con FBS al 10 % en presencia de GM-CSF (20 ng/mL, BioLegend, Cat# 576304) durante 9 a 12 días como se describió anteriormente43. Para la generación de macrófagos derivados de médula ósea (BMM), se cultivaron células de médula ósea en medio RPMI-1640 suplementado con FBS al 10 % en presencia de M-CSF (10 ng/mL, PeproTech, Cat# 315-02) para 7–9 días.

Generación de fibroblastos dérmicos de la piel: las láminas epidérmicas de los ratones se retiraron como se describió previamente69. Brevemente, las pieles se lavaron con PBS frío libre de Ca2+ y Mg2+ y luego se incubaron en un tampón de digestión que contenía 1 U de dispasa/mL a 37 °C durante 1 h. Las láminas epidérmicas se retiraron mecánicamente y la dermis restante se lavó en PBS libre de Ca2+ y Mg2+ 5 veces y se incubó en un tampón de digestión que contenía 2 mg/mL de colagenasa A (Roche), 100 µg/mL de DNasa I (Sigma, d4527) y BSA al 1 % en PBS libre de Ca2+ y Mg2+ a 37 °C durante 1–2 h. La suspensión resultante se filtró secuencialmente (VWR) a través de una malla de nylon de 100, 70 y 40 mm y se lavó dos veces con un tampón (PBS libre de Ca2+ y Mg2+ que contenía 1% de BSA y 2 mM de EDTA). Las células se cultivaron en medio RPMI-1640 complementado con FBS al 10%. Solo las células adherentes se usaron después de 2 a 3 días de cultivo.

Los niveles de IFN-β en BALF se determinaron utilizando un kit de inmunoensayo ProQuantum de IFN beta de ratón (ThermoFisher). Los niveles de IFN-α e IFN-β en los sobrenadantes de las BMDC cultivadas se determinaron mediante ELISA (PBL Biomedical Laboratories).

Los GM-CSF-BMDC de ratones WT o cGAS-/- se infectaron con MVA-OVA o MVA∆E5R-OVA a una MOI de 10 durante 16 h. Las células se lavaron con tampón MACS (Miltenyi Biotec) y se tiñeron con anticuerpos contra CD40 (3/23, Biolegend) y CD86 (GL-1, Biolegend). Los análisis FACS se realizaron utilizando LSRFortessaTM Cell Analyzer (BD Biosciences). Los datos se recopilaron con FACSDiva 8.0 y se analizaron con el software FlowJo (versión 10.5.3).

Las células cultivadas se colocaron en placas en portaobjetos de cámara Lab-TekTM II (ThermoFisher) y se fijaron en paraformaldehído al 4 % (p/v) a temperatura ambiente (TA) durante 10 min, se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,5 % (v/v) en PBS durante 5 min, y bloqueado en suero de cabra al 5% (Sigma), albúmina de suero bovino al 3% (Fisher) y Triton X-100 al 0,1% a temperatura ambiente durante 1 h. Los anticuerpos primarios se incubaron a 4 °C en las diluciones indicadas durante la noche: anti-Flag de ratón (1:1000, Sigma) y anti-cGAS (1:1000, Abcam). Después de tres lavados en PBS, los portaobjetos se incubaron con los anticuerpos secundarios indicados, incluidos el anti-ratón de cabra Alexa Fluor-647 (1:1000, Invitrogen) y el anti-conejo de cabra Alexa Fluor-488 (1:1000, Invitrogen) a temperatura ambiente durante 60 mín. Después de tres lavados en PBS, los portaobjetos se montaron en ProLong Gold Antifade Mountant (ThermoFisher). Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio confocal (Leica TCS SP8 o Zeiss LSM880).

Para obtener imágenes de lapso de tiempo de virisoma en MEF, las células se sembraron en portaobjetos de cámara Lab-TekTM II (ThermoFisher), se infectaron con MVA∆E5R en MOI 10 y se tiñeron con SiR-DNA fluorogénico (Cytoskeleton). Las células se incubaron a 37 °C suplementadas con CO2 al 5 %. Las imágenes se adquirieron con un ZEISS Axio Observer Z1. Todas las imágenes se procesaron posteriormente con el software Image J.

El plásmido indicador de IFN-β (pIFN-β-luc)70 fue proporcionado por Michaela Gack (Universidad de Chicago). pRL-TK se adquirió de Promega. El plásmido de expresión de STING humano fue proporcionado por Tom Maniatis (Universidad de Columbia). Las secuencias STING murinas (mSTING) se amplificaron mediante PCR y se clonaron en plásmidos pcDNA3.2-DEST. Los plásmidos cGAS humano (hcGAS) y cGAS murino (mcGAS) se adquirieron de Invivogen. V5–cGAS se amplificó por PCR y se clonó en plásmidos pcDNA3.2-DEST. pRK-HA-Ubiquitin-WT, pRK-HA-Ubiquitin-K48 y pBabe 12S E1A se adquirieron de Addgene. Ochenta genes de VVAC seleccionados se amplificaron mediante PCR a partir del genoma WR de VVAC y se subclonaron en pcDNA3.2-DEST utilizando el método de clonación Gateway (Invitrogen). Los genes E1A marcados con Flag y VACV marcados con Flag se amplificaron mediante PCR y se subclonaron en pcDNA3.2-DEST usando el método de clonación Gateway (Invitrogen). VACV E5R (aa: 55-341) se amplificó mediante PCR a partir del genoma WR de VACV y se subclonó en pcDNA3.1 y pQCXIP.

Las células HEK293T se pasaron a una placa de 6 pocillos. Al día siguiente, las células se transfectaron con tres plásmidos: VSVG, gag/pol y pQCXIP-E5R o pQCXIP con lipofectamina 2000. Después de 2 días, los sobrenadantes celulares se recolectaron y filtraron a través de un filtro de 0,45 μm y se almacenaron a -80 °C.

Las actividades de luciferasa de luciérnaga y Renilla se midieron usando el sistema Dual-Luciferase Reporter Assay de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega). Para detectar inhibidores de vaccinia de la vía cGAS/STING, plásmidos de expresión cGAS (50 ng) y STING (10 ng), junto con pIFN-β-luc (50 ng), pRL-TK (10 ng), así como seleccionados El plásmido de expresión del gen vaccinia o el plásmido de expresión de adenovirus E1A (200 ng) se transfectaron en células HEK293T. Veinticuatro horas después de la transfección, se recogieron y lisaron las células. Para evaluar los efectos de los inhibidores de vaccinia de la vía STING, el plásmido de expresión de STING (50 ng), junto con pIFN-β-luc (50 ng), pRL-TK (10 ng), así como la expresión del gen vaccinia seleccionado, construcciones o El plásmido de expresión de adenovirus E1A (200 ng) se transfectó en células HEK293T. La actividad relativa de luciferasa se expresó como unidades arbitrarias mediante la normalización de la actividad de luciferasa de luciérnaga bajo el promotor IFNB a la actividad de luciferasa de Renilla a partir de un plásmido de control, pRL-TK.

Las células se lisaron en tampón de lisis RIPA complementado con cóctel inhibidor de fosfatasa y proteasa Halt™ 1x (ThermoFisher). Para extraer proteínas citoplasmáticas y nucleares, las células se procesaron con el kit de extracción nuclear y citoplasmática NE-PER (ThermoFisher, 78833). Las muestras de proteínas se separaron mediante SDS-PAGE y luego se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se incubaron con anticuerpos primarios específicos para cGAS (CST, 31659), STING (CST, 13647), FLAG (Sigma, F3165), HA (Sigma, H3663), V5 (ThermoFisher, R960-25), mCherry (ThermoFisher, M11217), β-actina (Sigma, A2228), Lamin B1 (Sigma, ZRB1143) y GAPDH (CST, 2118). El anticuerpo C7 se produjo en nuestro laboratorio y se describió antes24. El anticuerpo E3 fue proporcionado amablemente por el Dr. Stuart N. Isaacs (Universidad de Pensilvania)71. Se usaron anticuerpos IgG anti-conejo, ratón o rata conjugados con HRP como anticuerpos secundarios (CST, 7074, 7076 o 7077). La detección se realizó utilizando sustratos SuperSignalTM (Thermo Fisher, 34577 o 34095).

Para detectar la proteína cGAS ubiquitinada durante la infección por el virus vaccinia, se infectaron BMDC con MVA a una MOI de 10 durante 6 h en presencia de MG132 (25 μg/mL). Las proteínas ubiquitinadas se purificaron usando Halo-4× UBAUBQLN1 como se describió anteriormente40. Brevemente, los extractos de células enteras (1 mg) se lisaron en tampón de lisis que contenía cloroacetamida 100 mM y se incubaron a 4 °C durante 16 h con 30 μL de perlas Halo-4x UBAUBQLN1 (volumen del paquete). Después de cuatro lavados con tampón de lisis que contenía NaCl 1 M y un último lavado en Tris 10 mM (pH 8,0), las proteínas se liberaron de Halo-4xUBAUBQLN1 usando tampón de muestra antes del análisis por SDS-PAGE. Para la cotransfección de cGAS y E5R, se transfectaron células HEK293T en placas de 10 cm con V5–cGAS junto con E5R-Flag o pcDNA3.1. 24 h más tarde, las células se trataron con MG132 (25 μg/mL) durante 6 h antes de lisar en tampón de lisis.

Para los ensayos de ubiquitinación de cGAS, se transfectaron células HEK293T en placas de 10 cm con V5-cGAS junto con HA-Ub-WT o HA-Ub-K48. 24 h más tarde, las células se infectaron con MVA o MVA∆E5R a MOI 10 durante 6 h en presencia de MG132 (25 μg/ml) y se lisaron en tampón de lisis RIPA (ThermoFisher, 89901) en hielo durante 30 min. Se añadió anticuerpo anti-V5 (ThermoFisher, R960-25) al lisado celular hasta una concentración final de 1 μg/mL y se incubó a 4 °C durante la noche en un rotador. Al día siguiente, se añadieron perlas magnéticas de proteína G (Bio-Rad, 161-4023) y se incubaron a 4 °C durante 2 h. Las perlas se lavaron cinco veces con tampón RIPA. Por último, las proteínas unidas a las perlas se desnaturalizaron en tampón SDS calentándolas a 98 °C durante 5 min antes de cargarlas en un gel SDS-PAGE.

Para el ensayo de interacción cGAS y E5, se transfectaron células HEK293T en placas de 10 cm con V5–cGAS junto con E5R-Flag o pcDNA3.1. Dos días más tarde, las células se lisaron en tampón de lisis Pierce IP en hielo durante 30 min. Los lisados ​​celulares se trataron con o sin 250 U/ml de benzonasa (Sigma, E8263) a 4 °C durante 30 min antes de mezclarlos con proteína G-agarosa (ThermoFisher, 20399). En BMDC, las células se infectaron con MVA∆E5R-E5R-Flag a una MOI de 10 durante 6 h. Las células se lisaron como antes. El anticuerpo cGAS (Abcam, ab252416) se añadió al lisado celular hasta una concentración final de 1 μg/ml y se incubó a 4 °C durante la noche en un rotador. Al día siguiente, se añadieron perlas de proteína G-agarosa y se incubaron a 4 °C durante 2 h. Las perlas se lavaron cinco veces con tampón de lisis IP. Por último, las proteínas en el tampón SDS se desnaturalizaron calentándolas a 98 °C durante 5 min antes de cargarlas en SDS-PAGE.

El ARN total se extrajo de los lisados ​​de células completas utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen) o con el kit RNeasy Plus Mini (Qiagen). Los ARN se transcribieron inversamente y se amplificaron mediante PCR usando el kit de síntesis de ADNc Verso (Thermo Fisher) y SYBRTM Green Master Mix (Thermo Fisher). Los ARN celulares se normalizaron a niveles de GAPDH. Los niveles de GAPDH se mantuvieron estables en BMDC bajo infección por virus43. El método ΔΔCt se utilizó para medir la expresión de genes, y las eficiencias de los ensayos de qPCR estuvieron entre el 90 % y el 110 %72. Todos los ensayos se realizaron en un sistema ABI 7500 y se analizaron con el software ABI 7500 SDS v.1.3 (Applied Biosystems) y siguieron MIQE73. La distribución de datos se evaluó con la prueba de Shapiro-Wilk. Las secuencias de cebadores se enumeran en la Tabla S1.

cGAMP se midió por LC-MS como se informó anteriormente74. Brevemente, los sedimentos celulares se complementaron con estándares internos de 80 fmol (15N10-cGAMP, generados internamente) y posteriormente se extrajeron en metanol al 80 % y ácido acético al 2 % y dos veces en ácido acético al 2 % para obtener extracto de metabolitos. cGAMP se enriqueció a partir de extractos combinados en columnas HyperSep Aminopropyl SPE (Thermo Scientific). Después de lavar dos veces con ácido acético al 2 % y una vez con metanol al 80 %, las muestras se eluyeron con hidróxido de amonio al 4 % en metanol al 80 %. Los eluyentes secados al vacío se disolvieron en agua y se analizaron en un HPLC Dionex U3000 acoplado con un espectrómetro de masas TSQ Quantiva Triple Quadruple (Thermo Scientific). La cromatografía utilizó resina LUNA NH2 (5 µm, Phenomenex) como fase estacionaria empaquetada en capilares de sílice de 0,1 mm DI × 70 mm L. Las fases móviles son acetonitrilo (A), bicarbonato de amonio 20 mM y solución acuosa de hidróxido de amonio 20 mM (B). El caudal es de 800 nL/min (0–4 min), 300 nL/min (4–19 min) y 600 nL/min (19–27 min), con un gradiente de 20 % B (0–3 min) , 50 % B (4 min), 80 % B (14–18 min) y 20 % B (19–27 min). cGAMP y el estándar se analizaron mediante monitoreo de reacción múltiple en el modo positivo con las siguientes transiciones: 675-136, 675-152, 675-476 y 675-524 para cGAMP; y 685-136, 685-157, 685-480 y 685-529 para el estándar 15N10-cGAMP. Los niveles endógenos de cGAMP se calcularon multiplicando las proporciones de cGAMP a estándar por 80 fmol (la cantidad de estándar añadido a cada muestra).

Se infectaron BMDC cultivadas con GM-CSF (1 × 106) de ratones WT o cGAS-/- con MVA o MVA∆E5R a una multiplicidad de infección (MOI) de 10. Las células se recolectaron 16 h después de la infección. El ARN total se extrajo de las células recolectadas en los puntos de tiempo indicados utilizando el Mini Kit RNeasy Plus (Qiagen) de acuerdo con el protocolo del fabricante, incluido el tratamiento con ADNasa I. La integridad del ARN total se analizó usando un Bioanalizador 2100 (Agilent Technologies). El ARN mensajero se preparó con el kit de preparación de bibliotecas de muestras de ARNm de cadena TruSeq (Illumina, San Diego, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las bibliotecas de ADNc finales normalizadas se agruparon y secuenciaron en un secuenciador Illumina NovaSeq6000 con 50 ciclos en los extremos de los pares. Las lecturas de secuenciación sin procesar en formato BCL se procesaron a través de bcl2fastq 2.19 (Illumina) para la conversión y demultiplexación FASTQ. Después de recortar los adaptadores con cutadapt (versión 1.18), STAR (versión 2.5.2) alineó y mapeó las lecturas de ARN al genoma de referencia humano GRCh38, y Cufflinks (versión 2.1.1) realizó la reconstrucción del transcriptoma. La abundancia de transcripciones se midió con gemelos en fragmentos por kilobase del modelo de exón por millón de lecturas mapeadas (FPKM). Se construyeron perfiles de expresión génica para análisis de expresión diferencial, agrupamiento y componente principal con el paquete DESeq2. Se utilizó el software GSEA del Instituto Broad para identificar funciones de genes expresados ​​diferencialmente. Los genes se clasificaron por el valor log2 FC obtenido a partir del análisis de expresión diferencial, y se utilizó la versión preclasificada de la herramienta para identificar rutas biológicas significativamente enriquecidas. Se generaron mapas de calor de rutas biológicas significativamente enriquecidas con el paquete R pheatmap (https://www.rdocumentation.org/packages/pheatmap/versions/1.0.12/topics/pheatmap).

Los gráficos de volcanes se generaron con el paquete R EnhancedVolcano (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/EnhancedVolcano.html).

Los datos de RNA-Seq para este proyecto se han depositado en Gene Expression Omnibus de NCBI, número de acceso GSE185431.

Se utilizó la prueba t de Student no pareada de dos colas para las comparaciones de dos grupos en los estudios. Los datos de supervivencia se analizaron mediante la prueba de rango logarítmico (Mantel-Cox). Los valores de p considerados significativos se indican en las figuras como sigue: *p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001. El número de animales incluidos en el estudio se discute en la leyenda de cada figura.

Todos los materiales únicos están disponibles a pedido de los autores correspondientes. La disponibilidad del anticuerpo que reconoce la proteína C7 del VVAC es limitada.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de RNAseq se han depositado en Gene Expression Omnibus (GEO) con el número de acceso GSE185431. Todos los demás datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el artículo y sus archivos de información complementaria. Los datos fuente se proporcionan en este documento.

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Agradecemos a la Instalación central de citometría de flujo y la Instalación central de citología molecular en el Instituto Sloan Kettering. Agradecemos a los Dres. Charles Rice y Stewart Shuman por sus útiles debates. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de NIH K-08 AI073736 (LD), R56AI095692 (LD), R03 AR068118 (LD), R35 GM132111 (HF) y MSK Technology Development Fund (LD), acuerdo de investigación patrocinado por IMVAQ Therapeutics (LD) y el Instituto de Investigación y Prevención del Cáncer de Texas, RP180725 (ZJC). ZJC es investigador en el Instituto Médico Howard Hughes. Esta investigación también fue financiada en parte a través de NIH/NCI Cancer Center Support Grant P30 CA008748.

Christian Zierhut

Dirección actual: Instituto de Investigación del Cáncer, Londres, SW3 6JB, Reino Unido

Servicio de Dermatología, Departamento de Medicina, Centro de Cáncer Memorial Sloan Kettering, Nueva York, NY, 10065, EE. UU.

Ning Yang, Yi Wang, Peihong Dai y Liang Deng

Departamento de Biología Molecular, Centro Médico Southwestern de la Universidad de Texas, Dallas, TX, 75390, EE. UU.

Tuo Li y Zhijian Chen

Laboratorio de Cromosomas y Biología Celular, Universidad Rockefeller, Nueva York, NY, 10065, EE. UU.

Christian Zierhut y Hironori Funabiki

Instalación central de recursos genómicos, Weill Cornell Medical College, Nueva York, NY, 10065, EE. UU.

Adrian Tan, Tuo Zhang y Jenny Zhaoying Xiang

Programa de Biología Celular, Instituto Sloan Kettering, Centro de Cáncer Memorial Sloan Kettering, Nueva York, NY, 10065, EE. UU.

Alban Ordureau

Programa de Oncología Humana y Patogénesis, Centro de Cáncer Memorial Sloan Kettering, Nueva York, NY, 10065, EE. UU.

Liang Deng

Weill Cornell Medical College, Nueva York, NY, 10065, EE. UU.

Liang Deng

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Contribuciones de los autores: NY y LD participaron en todos los aspectos de este estudio, incluida la concepción del proyecto, el diseño y la realización de experimentos, el análisis y la interpretación de datos, y la redacción de artículos. NY diseñó la pantalla para los inhibidores de vaccinia de la vía de detección de ADN citosólico y realizó la mayoría de los experimentos. YW ayudó a NY en la detección y validación de inhibidores de vaccinia. YW y LD realizaron experimentos de RNA-seq. YW y LD generaron varios virus de deleción VACV E5 y realizaron estudios de patogénesis. PD y TL están involucrados en la medición de cGAMP en BMDC infectados por vaccinia y MVA. AT, TZ y JZX analizaron los datos de RNA-seq y colaboraron en la preparación del manuscrito. CZ, HF, AO y ZJC ayudaron en el diseño experimental, la interpretación de datos y la preparación del manuscrito. LD proporcionó la supervisión general del proyecto.

Correspondencia a Ning Yang o Liang Deng.

El Centro de Cáncer Memorial Sloan Kettering presentó una solicitud de patente para el descubrimiento de inhibidores virales de vaccinia de la vía de detección de ADN citosólico y su uso para mejorar MVA y vaccinia como agentes oncolíticos y vectores de vacunas. La patente ha sido licenciada a IMVAQ Therapeutics. LD y NY son cofundadores de IMVAQ Therapeutics. Los autores restantes declaran no tener intereses contrapuestos.

Nature Communications agradece a François Meurens, Luis Sigal y los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Yang, N., Wang, Y., Dai, P. et al. Vaccinia E5 es un importante inhibidor del sensor de ADN cGAS. Nat Comun 14, 2898 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38514-5

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Recibido: 02 junio 2022

Aceptado: 05 mayo 2023

Publicado: 22 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-38514-5

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